第四军医大学学报1999年第20卷第5期

苏映军陈璧汤朝武胡大海姜笃银贾赤宇

摘要 目的：研究SV40(simian virus 40)病毒对人角朊细胞的体外转化作用以及转化后细胞生物学特性的改变.方法：采用体外共培养法以SV40野生型病毒感染人包皮角朊细胞，观察病毒基因在细胞内的表达以及细胞表型的改变情况.结果：分离获得了可长期体外培养的SV40转化细胞克隆，已传23代以上，体外存活超过250 d；DNA印迹实验显示SV40大T基因已整合至细胞染色体内，间接免疫荧光检测示多数细胞胞核内有大T基因产物的表达；转化细胞对裸鼠无致瘤性，并可正常表达角蛋白.结论： SV40病毒转化人角朊细胞后可使其在体外长期培养，该细胞的获得为进一步研究外源性基因对角朊细胞生长的调控奠定了基础.

关键词:SV40病毒角蛋白细胞细胞转化

0引言

生理条件下，正常人皮肤基底层角朊细胞不断增殖、分化，最终形成表皮角质层，完成细胞的生命周期. 然而，角朊细胞在体外的生长与分化受培养液成分的影响较大，体外培养较为困难. 1975年，Rheinwald等^［1］改善了培养条件并采用了3T3滋养细胞使角朊细胞能够在体外传代培养至4代～6代. 随着对细胞分化研究的深入，Yuspa等^［2］采用低Ca²⁺培养基降低了角朊细胞体外培养时的分化程度，可使其传代培养至第8代～10代. 即便如此，仍无法获得永生化人角朊细胞系，因而无法满足相关疾病研究的需要. 为克服以上不足，我们利用SV40(simian virus 40)病毒可转化某些细胞使其具有永生化生长的特性，采用病毒基因转化细胞技术，进行体外细胞转化，以获得能够长期培养的人角朊细胞.

1材料和方法

1.1材料野生型SV40病毒，由北京医科大学肿瘤病研究所提供. 皮肤组织来源于包皮环切术所获标本. 细胞无血清培养基K-SFM为Gibco公司产品. 实验用裸鼠购自本校实验动物研究中心.

1.2方法

1.2.1细胞培养参照汤朝武等^［3］报道的方法将角朊细胞分离成单细胞悬液，离心后以K-SFM重悬细胞，按1×10⁴/cm²细胞密度将角朊细胞接种于培养皿内. 24 h后换液，以后隔日换液并于倒置显微镜下观察细胞生长状况. 细胞生长至70%融合度时行消化传代培养.

1.2.2病毒感染及细胞克隆的分离将培养至30%融合程度的原代角朊细胞以1.25 g/L胰酶溶液室温消化2 min，当镜下见细胞呈圆形但尚未脱离培养皿壁时，加入含SV40病毒的培养基培养8 h，之后将培养基更换为K-SFM，培养48 h后按同样步骤再次以病毒液作用于培养细胞并定期观察. 待有明显转化细胞克隆形成后，分离生长良好的克隆，行传代培养，定期收集细胞进行下文所述指标的检测.

1.2.3大T基因的检测及T抗原间接免疫荧光检测参照Blin等^［4］方法提取细胞基因组DNA，将DNA样品转移至硝酸纤维素膜上，以地高辛标记的1.17 kb大T基因DNA探针按照鄂征报道的方法进行斑点印迹实验^［5］. 同时将生长在盖玻片上的细胞以丙酮固定后，加入1∶40稀释度小鼠抗大T抗原单抗sc-147(Santa Cruz)，室温下孵育30 min，PBS洗3次，再加入1∶50稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG(Santa Cruz)，室温作用30 min，PBS洗3次，甘油封片，荧光显微镜下观察.

1.2.4细胞角蛋白间接免疫荧光检测方法同上，其中培养的细胞为第20代病毒转化细胞，一抗采用鼠抗人角蛋白多抗(Dako)，二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG(Santa Cruz).

1.2.5裸鼠致瘤实验收集第7代, 18代转化细胞，离心洗涤，以PBS重悬并调整细胞密度至1×10¹⁰/L，于4周龄裸鼠背部皮下注射0.1 mL细胞悬液，定期观察. 皮肤鳞癌细胞株VX-2及第3代正常角朊细胞分别为阳性和阴性细胞对照.

1.2.6细胞生长曲线将第7代, 18代SV40转化细胞及第3代正常人角朊细胞以K-SFM重悬后，调整细胞密度为1×10⁷/L，接种至24孔组织培养板，1 mL/孔，以后隔日以噻唑蓝(MTT)呈色法^［6］测定细胞的生长状况，方法为测定孔内加入5 g/L的MTT溶液100 μL，37 ℃孵育4 h，弃培养基，PBS洗2次，加入二甲基亚砜(DMSO)1 mL，37 ℃放置15 min，振荡5 min，将DMSO转移至1 mL比色杯中测定570 nm波长下的A值. 以时间参数为横坐标，A值为纵坐标作点线图，分析细胞生长情况.

实验数据采用我校统计学教研室SPLM统计软件包进行方差分析，P＜0.05为显著性差异界限.

2结果

2.1培养细胞镜下观察正常的角朊细胞在体外以K-SFM培养时呈椭圆形细胞形态，细胞融合时多为“鹅卵石”状排列（Fig 1）. 随着培养代数的增加，细胞逐渐变大，传代培养7代～10代后细胞老化，失去生长能力并从培养皿壁脱落. 加入SV40病毒共培养后,转化细胞逐渐形成克隆样细胞灶，与较大的未转化细胞共存于培养皿内. 经不断传代后，较大的老化细胞在换液时被去除，培养皿内存留者为多个圆形转化细胞灶，细胞体积较小且较为均一，倒置显微镜下见细胞呈典型的多角形和椭圆形，个别细胞有明显的伪足伸出（Fig 2）. 分离并单独培养的细胞克隆在23代仍具有增殖能力，而且，细胞未丧失接触抑制的特性，在完全融合状态下未发生继续增殖复层的现象（Fig 3）.

2.2斑点杂交实验第7代, 22代SV40转化细胞基因组DNA样本中大T基因探针杂交结果阳性，正常人角朊细胞DNA印迹实验结果阴性（Fig 4）. 间接免疫荧光染色显示转化的人角朊细胞核中有大T抗原的表达（Fig 5）. 说明SV40大T基因已整合至转化的角朊细胞染色体内并表达其编码产物.

2.3细胞角蛋白的表达第20代转化细胞显示较强的角蛋白反应（Fig 6），表明分离获得的转化细胞克隆来源于表皮角朊细胞而非混杂的其它皮肤组织细胞.

2.4致瘤性鳞癌细胞VX-2注射裸鼠3 wk后可见明显肿瘤形成，而第7代, 18代SV40转化细胞及第3代正常人角朊细胞接种裸鼠皮下3 mo未见肿瘤形成.

2.5生长曲线分析正常人角朊细胞在接种后第4日～8日进入增殖活跃的对数生长期，第10日左右细胞处于完全融合状态而停止生长. 转化后的细胞于接种后第4日起进入对数生长期，第7代的转化细胞培养至第8日～10日时进入融合状态而增殖减缓，第18代转化细胞培养至第10日时未达到融合状态，并继续增殖（Fig 7），至14 d～16 d时进入完全融合状态而停止生长. 在对数生长期内，正常角朊细胞的倍增时间约为32 h，第7代转化细胞约为37 h，第18代转化细胞约为66 h. 经统计学分析，第7代转化细胞各时间点检测的A值与正常角朊细胞间无明显差异，而第18代转化细胞培养6 d之后所测A值与正常细胞相比差异显著. 说明转化后的细胞传代培养至第7代时，其增殖率与正常角朊细胞间无差别；随着培养时间的延长和培养代数的增加，其增殖率有所降低.

3讨论

通过基因转化技术可使正常组织细胞能够被长期培养甚至发生“永生化”改变，应用该技术已建立多种体外稳定生长的细胞系，其中采用SV40病毒基因体外转化细胞是较为常用且有效的方法之一^［7～9］. 本实验采用SV40病毒感染细胞的方法，分离获得了可在体外长期培养、无致瘤性的人皮肤角朊细胞，为研究角朊细胞在烧伤创面修复中的作用提供了便利条件.

图 1正常人包皮角朊细胞形态

fig 1Normal human foreskin kertinocytes ×200

2第15代转化角朊细胞克隆

fig 2Transformed keratinocyte clone of passage 15 ×200

3第23代转化细胞完全融合状态

fig 3Complete confluence of transformed keratinocytes of passage 23 ×200

4DNA印迹实验结果

fig 4Results of southern blotting

A: Positive control. B: Negative control. C, D: Chromosomal DNA samples from transformed cells of passage 7 and 22.

5转化的人角朊细胞核内大T抗原的表达

fig 5Expression of Large T antigen in transformed human keratinocyte nuclei

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