第四军医大学学报1999年第20卷第8期

廖文俊刘彦仿刘玉峰

摘要目的： 构建pEGFP-HPV16E6/E7表达载体，观察其在角朊细胞中的瞬时表达.方法： 基因重组技术，基因转染技术.结果： 酶切鉴定证实HPV16E6/E7片段已克隆到pEGFP-N3的EcoR I和BamH I位点之间，在转染角朊细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达.结论： pEGFP-HPV16E6/E7表达载体便于观察, 转染细胞中HPV16E6/E7-GFP融合蛋白的表达情况及蛋白定位，适用于对HPV16E6/E7分子生物学特性及致瘤机理的研究.

关键词：人乳头瘤病毒表达载体构建基因转染

0引言

人乳头瘤病毒（HPV）是一种常常感染复层上皮细胞并引起乳头瘤样改变及良性肿瘤的小DNA病毒，目前的研究已注意到了HPV16与恶性肿瘤的关系. 为了解HPV16E6/E7癌基因的分子生物学特性及其在细胞转化过程中的作用，本实验构建了pEGFP-HPV16E6/E7表达载体，并对其在角朊细胞中的瞬时表达情况进行了检测.

1材料和方法

1.1材料质粒pLXSN16E6/E7为美国癌症研究中心Hutchinson教授惠赠,该质粒在载体pLXSN的EcoR I和BamH I之间插入16型人乳头瘤病毒E6和E7 (HPV16E6/E7)开放读框,约800 bp；质粒pEGFP-N3为本校基础部病理学教研室赵利军博士惠赠（美国CLONTECH生物技术公司产品），该质粒含绿色荧光蛋白（green fluorescent protein， GFP）序列，在细胞内表达后可发出绿色荧光. 角朊细胞无血清培养基（KC-SFM）, 脂质体转染试剂盒（LIPOFECTAMINETM Kit）均为美国GIBCO BRL公司产品，限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自华美生物工程公司.

1.2方法

1.2.1pEGFP-HPV16E6/E7表达载体的构建碱裂解法提取质粒,用EcoR I和BamH I进行双酶切, 12 g/L琼脂糖电泳,冻溶法回收HPV16E6/E7片段及线性化pEGFP-N3,用T4 DNA连接酶将目的片段连接在pEGFP-N3的EcoR I和BamH I之间. 连接产物转化JM109，随机挑取抗性克隆，碱裂解法提取质粒，用EcoR I和BamH I进行双酶切, 12 g/L琼脂糖电泳，紫外透射反射检测仪上观察酶切结果.

1.2.2基因转染胰酶消化法分离、培养原代皮肤角朊细胞,将细胞种植于铺有盖玻片的培养皿中，待细胞生长达60%～70%汇融时,用Lipofectamine介导法进行基因转染,取pEGFP-HPV16E6/E7质粒2 μg, Lipofectamine 12 μL, 转染5 h后终止反应,18 h后换成新鲜KC-SFM, 72 h后在荧光显微镜下观察基因的瞬时表达情况.

1.2.3表达检测用PBS洗细胞铺片2次, 40 g/L多聚甲醛(PBS配制)室温固定30 min, PBS振洗,在荧光显微镜下, 488 nm激发波长下观察,表达GFP的细胞发绿色荧光.

2结果

2.1pEGFP-HPV16E6/E7表达载体的酶切鉴定pEGFP-HPV16E6/E7重组载体经EcoR I和BamH I双酶切, 12 g/L琼脂糖电泳,紫外透射反射检测仪上观察可见一条800 bp的目的片段和4.7 kb的载体片段（Fig 1），与预测结果相符，表明HPV16E6/E7已被插入到 pEGFP-N3中，将该重组载体命名为pEGFP-HPV16E6/E7.

图1pEGFP-HPV16E6/E7酶切鉴定Fig 1Identification of pEGFP-HPV16E6/E7 enzyme digestion

A: pLXSN16E6/37: EcoR I+BamH I; B: pEGFP-HPV16E6/E7: EcoR I+BamH I; M: λDNA/HindⅢ.

2.2绿色荧光蛋白的瞬时表达角朊细胞基因转染72 h后,取出细胞铺片,在荧光显微镜下观察,发现约5%的细胞表达GFP,表现为细胞发出明亮的绿色荧光,主要集中在细胞质内,部分细胞核也有荧光,这些细胞多成对出现,或数个发光细胞集聚在一起（Fig 2）. 此外，还可见到个别发出弱绿色荧光的细胞. 未转染的正常角朊细胞未见绿色荧光.

图2转染角朊细胞表达GFP， 示细胞发出绿色荧光

Fig 2GFP expression in transfected keratinocytes

3讨论

人乳头瘤病毒（HPV）是一种嗜上皮性DNA病毒，由两条互补DNA链构成，长约8 kb，基因组中共有8个主要的开放读框，其中E6， E7开放读框为调节病毒生长的编码区,目前已鉴定出70种HPV基因型，多数具有特异性的感染部位和特征性的临床表现^［1］. 已有文献［2,3］报道在生殖器、口腔和皮肤的鳞状细胞癌损害中检测出HPV16，提示它可能在这些恶性肿瘤的发生学中具有意义. 由于发现在宫颈癌组织和细胞株中能选择性地保留和表达HPV16E6/E7，而且转染HPV16E6/E7的一些上皮细胞（包括角朊细胞）能够获得永生化，这种永生化细胞如在活化ras或其它因素的协同作用下还可发生转化，因而认为，E6/E7是HPV16的主要功能区. 其作用表现在参与了肿瘤形成的多个阶段，包括诱导细胞永生化和分化抑制、协同作用使永生化细胞发生转化、并维持转化细胞的恶性表型^［4］.

为研究HPV16E6/E7癌基因的分子生物学特性及其与细胞转化的关系，我们构建了HPV16E6/E7的真核表达载体，实验所选择的pEGFP-N3载体中带有绿色荧光蛋白（GFP）序列，这种新型的报告分子在暴露于紫外线后即可发出明亮的绿色荧光，并可在荧光显微镜下观察到这种绿色荧光，因而，pEGFP-N3常被用于检测细胞中GFP融合蛋白的表达情况及蛋白定位^［5,6］. 我们通过基因重组技术成功构建了pEGFP-HPV16E6/E7表达载体，并转染角朊细胞，在荧光显微镜下观察到发出绿色荧光的细胞，提示转入的质粒已在角朊细胞中表达出HPV16E6/E7-GFP融合蛋白. 由于这种载体在转染细胞后很快就能通过观察荧光细胞而检测出基因的瞬时表达情况，因而，为基因转染研究中确定转染效率、HPVE6/E7的表达情况及蛋白定位等提供了直观的靶标记，有望被应用于对HPV16E6/E7分子生物学特性及致瘤机理的研究.

基金项目：国家自然科学基金资助项目No. 39570656

作者简介：廖文俊，男，1963-07-17生,四川省富顺县人，汉族. 1984-08第三军医大学毕业，博士，主治医师，发表论文10余篇. 电话：(029)3375405

作者单位：廖文俊刘玉峰第四军医大学：西京医院皮肤科

刘彦仿基础部病理学教研室，陕西 西安 710033

参考文献

1 Androphy EJ. Molecular biology of human papillomavirus infection and oncogenesis. J Invest Dermatol, 1994;103(2):248-256

2 Halbert C, Demers GW, Galloway DA. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J Virol, 1991;65(1):473-478

3 Matlashewski G, Schneider J, Banks L et al. Human papillomavirus type 16 DNA cooperates with activated ras in transforming primary cells. EMBO J, 1987;6(6):1741-1746

4 廖文俊，刘玉峰，刘彦仿. HPVE6/E7基因在角朊细胞转化过程中的作用. 国外医学皮肤性病学分册,1997;23(6):275-278

5 Yang TT, Cheng LZ, Kain SR. Optimized codon usage and chromophore mutations provide enhanced sensitivity with the green fluorescent protein. Nucleic Acids Res, 1996;24(22):4592-4593

6 Plautz JD, Day RN, Dailey GM et al. Green fluorescent protein and its derivatives as versatile markers for gene expression in living drosophila melanogaster,plant and mammalian cells. Gene, 1996;173(1):83-87