第四军医大学学报1999年第20卷第7期

杨敏刘新平药立波张晓光苏成芝陈常庆

摘要目的：获取HBV 前S区基因（HBVPreS），并进行序列测定，为今后研究其机理及应用创造条件.方法：用PCR方法从含HBV基因组的模板中扩增PreS基因，重组入 Bluescript 载体，用自动测序仪，采用荧光素标记的引物，测定目的基因的序列.结果：成功地扩增到PreS区全长基因，测出的序列与已知的HBV病毒的adr亚型的前S区基因序列一致.结论：构建了含PreS区基因的重组克隆，为以后的深入研究奠定了基础.

关键词:HBV前S区基因基因扩增序列分析

0引言

在HBV进入人体引起抗原性的过程中，前S区编码的前S抗原起了非常重要的作用，它除了与S抗原共同组成HBV的表面抗原（HBsAg）外，在PreS区中的PreS2区内有1个多聚人血清白蛋白受体的识别序列^［1］，能介导HBV吸附在肝细胞上. 对于HBV作用机制的认识还很有限，目前认为前S抗原参与介导了HBV吸附于肝细胞上，至于在肝细胞上存在其配体的形式以及PreS与配体结合后的功能还有待深入研究. 我们自行设计引物，扩增出前S区基因，并成功地加以克隆，测序，为今后进行表达，研究与之结合的配体，从而阐明乙型肝炎病毒嗜肝的机理奠定基础.

1材料和方法

1.1材料Bluescript质粒，DH5α菌种由本室保存，PCR模板由全军基因诊断研究所阎小君副教授赠送，DNA重组所用各种限制性内切酶，T4 DNA连接酶，Rnasin均购自Promega公司，PCR反应系统（Taq DNA聚合酶，dNTP, 10xPCR缓冲液）购自华美生物工程公司.

1.2PCR引物设计由Genebank登录，下载已发表的9种乙肝病毒的全序列，在计算机辅助分析下根据前S序列设计1对引物如下. 该引物由西安美联生物公司合成，PCR反应退火温度58℃，30次循环.

P1：5′CGGAATTCATGGGAGGTTGGTCT3′,为正链引物，引入EcoR I酶切位点.

P2：5′CGGGATCCTTAGTTCGGTGCAGG3′,为负链引物，引入BamH I酶切位点.

1.3PCR产物克隆取特异性好的扩增产物加2.5倍体积无水乙醇及1/10体积的3 mol/L NaAc沉淀回收产物，溶于适量TE. 酶切，电泳，质粒DNA的制备，DNA重组，转化宿主菌方法均参照文献［2］进行，以酶切法及序列测序鉴定阳性克隆.

1.4测序采用荧光素标记的Bluescript的2对引物，在PE公司生产的373 DNA 全自动测序仪上进行序列测定.

2结果

2.1PreS的PCR扩增在50 μL PCR反应体系中进行30次循环，取10 μL电泳，结果见1条长约520 bp的扩增产物，片段大小符合设计，未见非特异性扩增带（Fig 1）.

图 1PreS基因的 PCR扩增

Fig 1Amplification of PreS gene by PCR

1. PreS gene; 2. PCR-Marker(1 543,994,695,515,377 and 237 bp fragment from top to bottom).

2.2重组体的构建，阳性克隆的筛选和鉴定回收520 bp的片段用EcoR I与BamH I做双酶切，乙醇沉淀同上. 在T4连接酶的作用下与用同样酶切的Bluescript质粒，12℃～16℃连接过夜，使PreS片段插入到质粒的多克隆位点中. 挑取5个重组体转化的菌落，提取质粒，经EcoR I与Bam H I双酶切鉴定，切下520 bp为阳性克隆，将阳性克隆命名为pBS51（Fig 2）.

图 2Bluescript-PreS 重组克隆酶切鉴定

Fig 2Identification of Bluescript-PreS recombinant clone by EcoR I and BamH I digestion

1. PCR-Marker(1 543,994,695,515,377 and 237 bp fragment from top to bottom); 2. Plasmid fragment and inserted gene

2.3PreS序列测定阳性克隆采用荧光素标记的Bluescript的2对引物，测序结果如Fig 3. 同文献中已发表的序列进行比较^［3］，与HBVadr亚型的前S区基因序列一致.

GAA TTC ATG GGA GGT TGG TCT TCC AAA CCT CGA CAA GGC ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAT CCT CTG GGA TTC TTT CCC GAT CAC CAG TGG ACC CTG CGT CGG AGC CAA CTC AAA CAA TCC AGA TTG GGA CTT CAA CCC CAA CAA GGA TCA TTG GCC AGA GGC AAA TCA GGT AGG AGC GGG AGC ATT CGG GCC AGG GTT CAC CCC ACC ACA CGG CGG TCT TTT GGG GTG GAG CCC TCA GGC GCT CAG GGC ATA TTG ACA ACA GTG CCA GCA GCA CCT CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA AGA CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC ATG CAG TGG AAC TCC ACA ACA TTC CAC CAA GCT CTG CTA GAT CCC AGA GTG AGG GGC CTA TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCC GGA ACA GTA AAC CCT GTT CCG ACT ACT GCC TCA CCC ATA TCG TCA ATC TTC TCG AGG ACT GGG GAC CCT GCA CCG AAC TAA GGA TCC

图 3PreS基因编码区序列

fig 3The nucleotide sequence of PreS gene plus EcoR I and BamH I recognition sites

Underlined are the recognition sites.

3讨论

在HBV基因组中，已确定的基因编码区有4个，即S,C,X和P区，每个区都有自已的开放读框，各区之间互有重叠，但并不影响各基因编码. S区含有3个起始密码子，分别起始PreS1, PreS2和S基因，它们有共同的终止密码子. PreS1基因的长度存在着很大变异，不同亚型的长度不同，编码氨基酸数从108-119个不等，组成前S1蛋白. 而PreS2和S的长度固定，分别编码55和226个氨基酸，组成相应的前S2和S蛋白^［1，4］. 前S1，前S2，S蛋白共同构成HBV的表面抗原. 前S抗原（前S1+前S2）在HBV组织特异性乃至致病性方面都发挥重要作用. 即认为前S1蛋白的存在，标志着HBV的复制，肝细胞受体的主要结合在前S1的21～47位氨基酸之间^［5，6］，而前S2蛋白是亲水性的，不含二硫键，前S2区有多聚人血清白蛋白受体的结合位点，能特异性地与人血清中的多聚血清白蛋白结合. 已知肝细胞本身也有这种受体，Milich^［7］认为，HBV可能通过多聚血清白蛋白介导识别和吸附于肝细胞. 在前S1和前S2蛋白上存在着许多抗原决定簇，有些表位为T细胞的抗原决定簇，有些表位为B细胞的抗原决定簇，这些抗原决定簇所对应的抗体均为具有保护机体免受病毒攻击的保护性抗体. 由以上可以看出前S蛋白不论对病毒本身，还是人们利用它对HBV进行防治都具有重要意义.

参照Genebank中发表的HBV基因组的全序列，找出前S区，分别设计了3′端引物和5′端引物，在5′端引物引入了EcoR I酶切位点，EcoR I酶切位点紧接起始码，在3′端终止码后引入了BamH I酶切位点，同时为了保护酶切位点，分别引入了2个保护碱基，这样便于今后的克隆与表达. 同时我们又将测序结果输入计算机，进行分析发现克隆的基因为一开放读框，共编码174个氨基酸，其中无半胱氨酸残基，与已发表^［3］的HBVadr亚型的前S区序列一致. HBV病毒adr亚型，经流行病学调查所证，也可为我国HBV的常见亚型.

基金项目：国家自然科学基金资助项目No. 39870699

作者简介：杨敏，女，1971-06-04生，四川省崇庆市人，汉族，1995年毕业于第四军医大学，助教，硕士生. 导师苏成芝、药立波. 电话：（029）3374516

作者单位：杨敏刘新平药立波张晓光苏成芝第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室, 陕西 西安 710033

陈常庆中国科学院上海生物工程中心

参考文献

1 Neurath Ar, Strick N. Antigenic mimicry of an immioglobulin A epitope by a hepatitis B virus cell attachment site. Virology, 1990; 178(2):631-644

2 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Monocular cloning , a laboratory manual. Book 1.2nd.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:5-82

3 One Y. The complete nucleotide sequence of the cloned DNA of hepatitis B virus subtype adr and adw. Nucleic Acids Res，1987;281:646-678

4 Genem D. The molecular biology of the hepatitis B virus. Annu Rev Biochem,1987; 56:651-679

5 Petit MA, Capel F, Zoulin F et al. PreS antigen expression and anti-PreS response in hepatitis B virus infection. Arch Virol Suppl,1992;4: 105-112

6 Sominskaya I, Pushko P, Dreilina D.Determination of the minimal length of PreS1 epitope recognized by a monocl