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潘德思田靫陈兰英
关键词：心肌病，肥大性基因
心肌肥厚是常见的心血管疾病，发生机制至今仍不清楚。迄今通过候选基因筛选和定向克隆已经发现了好几个家族遗传性心肌肥厚的致病基因，而对于大多数不具备明显遗传倾向的心肌肥厚的相关基因仍有待研究。本实验基于心肌肥厚过程中基因表达所发生的变化，采用cDNA差减杂交法分离出有表达差异的基因。为了消除心脏组织中其它细胞对心肌细胞的干扰，实验设计中除采用心肌组织材料外同时采用体外灌流分离的心肌细胞，两组材料按同样流程进行后续的基因分离操作。方法：首先建立腹主动脉绑扎的心肌肥厚大鼠模型(成年Wistar大鼠)，假手术大鼠作为对照，分别在术后第1天、第3天和第4周处死大鼠取出心脏。一组心脏采用离体灌流分离左心室心肌细胞，另一组则直接取左心室心肌组织。以下操作两组完全相同：包括提取RNA、cDNA合成、cDNA片段补平后接上设计好的接头(含EcoRⅠ位点的21bp单平末端接头)，按照稍作修改后的程序(疾病组和对照组cDNA分别作为Driver或tester同时进行两套杂交)进行差减杂交。杂交5轮后将遗留下的cDNA片段插入pBSKS载体，转化受体菌JM109建立差减文库。然后以肥厚组和对照组的cDNA分别作为探针与建立的文库进行菌落原位杂交，从两组杂交中挑选出有信号强度差异的克隆子，最后分别以疾病组和对照组原始的cDNA作探针，与初筛的阳性克隆子进行DNA-cDNA斑点杂交，确证在两组材料中存在表达量差异的克隆子，对其中插入的cDNA片段进行序列测定并和GeneBank作同源性比较。结果：分别在3个不同时期的两组材料中共分离出二十几个基因片段，其中以心肌组织为材料分离出20个片段(第1天有4个上调基因片段；第3天有5个上调、6个下调基因片段；第4周有5个上调基因片段)；以灌流分离的心肌细胞为材料得到8个片段(第1天有3个上调、1个下调基因片段；第3天有4个上调基因片段)。杂交结果显示，在心肌肥厚和对照组间确实存在表达差异。同源性比较分析表明，只有一个片段与已知基因(大鼠细胞色素b基因，Cytb)完全同源，其它片段与任何已知基因没有完全的同源性；另外在不同取材时期获得的差异性片段重复性较差，同时分别从组织和心肌细胞材料中得到的大部分片段也不相同，提示在心肌肥厚发生过程中，心脏组织的基因表达存在着时间上和空间上的调控。具体机制有待进一步研究，同时还需要对本研究分离的基因片段进行功能鉴定以确定其与心肌肥厚发生的真正关系。
△国家自然科学基金(39670299)资助
作者单位：中国医学科学院中国协和医科大学阜外医院生化研究室，北京100037
