第三军医大学学报1999年第21卷第12期

周人杰肖颖彬张国强王志新周德昌

提要目的：研究全反维甲酸(ATRA)等干扰因子对肺癌细胞株A549侵袭、增殖及ICAM-1分子表达的调节作用。方法：根据细胞穿过铺有Matrigel胶多孔膜数量检测细胞侵袭力，用改良龙胆紫吸收比色计数法检测细胞增殖，以流式细胞分析和酶联免疫吸附试验检测ICAM-1、sICAM-1表达水平。结果：A549经ATRA处理后，细胞表面ICAM-1表达降低，体外侵袭力明显降低，体外增殖明显抑制；IFN α不增加细胞ICAM-1表达，但抑制体外增殖及体外侵袭力；IL-1明显增强细胞表面ICAM-1表达及培养上清sICAM-1含量，体外侵袭力有增高趋势。结论：ATRA、IFN α、IL-1对A549细胞体外增殖及ICAM-1、sICAM-1表达有不同的调节作用，而对其转移潜能具有不同调变作用。

关键词：全反维甲酸细胞株体外侵袭力ICAM-1

恶性肿瘤的侵袭与转移是受多因素调控的复杂过程，涉及肿瘤细胞恶性增殖、肿瘤组织新生血管形成、肿瘤细胞粘附、分泌蛋白酶降解基质及肿瘤细胞迁移运动等一系列过程。其中介导细胞粘附作用的细胞表面粘附分子的表达及其在肿瘤中的作用，是目前肿瘤研究中的一个热点^［1］。ICAM-1高表达的肿瘤细胞易于脱离母体，随淋巴细胞游走，而发生转移^［2］。在人类流行病学、动物实验及临床研究均已证实维甲酸(Retinoic acid,RA)类可用于肺癌的化学预防及治疗^［3］。我们研究了全反维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)等干扰因子对肺癌细胞株A549体外增殖、侵袭力及ICAM-1、sICAM-1表达水平的影响，旨在探讨ATRA等干扰因子对肿瘤转移潜能的影响及ICAM-1分子在肿瘤侵袭中的作用。

1材料与方法

1.1细胞及其处理方法

A549细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基培养，适时更换培养液及传代，逐渐降低培养液中小牛血清浓度直至无血清培养。细胞分别加入5 μmol/L ATRA、1000 U/ml IFN α、200 U/ml IL-1(购于北京中山公司)终浓度的培养液，对照组为相应的培养液，37°C孵育24 h，用于实验。

1.2体外侵袭实验

将200 μlNIH 3T3细胞培养上清液作为趋化物加入Boy-den小室(美国Millipore公司)的下室，上下室之间由直径12 mm、孔径12 μm的多孔聚碳膜分隔，在膜上铺50 μl(50 μg蛋白，DMEM稀释)基质胶Matrigel(北京医科大学提供)，胶干后，将不同处理的400 μl(2×10⁵个细胞)分别加入上室。37°C 5% CO₂孵育6 h后取出膜，擦去膜上面未穿过的细胞及基质胶，用甲醇固定，HE染色后，在显微镜下将多聚碳膜分成9等格，分别计数9格内的细胞数，取其平均值，即为每格内侵袭的细胞数。每组设2个样本，重复3次。

1.3体外增殖检测

采用Gillies等^［4］建立的改良龙胆紫吸收比色计数法。将待计数的细胞接种于24孔细胞培养板中，置37°C 5%CO₂孵育7 h，使细胞充分贴壁，以1%戊二醛-Hank's液固定15 min后，以0.1%无离子龙胆紫溶液1 ml染色30 min；将培养板置于1 L的大烧杯中，在其底部以连续缓流的无离子水(0.5 ml/min)脱染15 min，于空气中自然干燥，以0.2% TritonX-100溶液溶解细胞，在室温25°C左右，波长为590 nm分光光度仪上检测光密度(OD)值。以已计数的A549细胞0.75、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、10.0、12.5×10⁴/ml接种于24孔培养板，按上法操作，建立细胞数与光密度关系的标准曲线。以4.0×10⁴/ml细胞接种于24孔培养板中，分别加入5 μmol/L ATRA、1000U/ml IFN α、200U/ml IL-1的培养液，对照为相应培养液，37°C孵育48 h，按上法检测各孔OD值，根据标准曲线求出细胞数，每例设6个复孔。

1.4细胞表面ICAM-1表达水平的检测

取不同处理的A549细胞，加入鼠抗人ICAM-1(CD54)单抗(美国ZYMED公司产品)，阴性对照以PBS代替一抗，4°C孵育30 min，PBS洗3遍，加入FITC标记的羊抗鼠IgG(购于北京中山公司)，4°C孵育30 min，PBS洗3遍后，用FACstar流式细胞仪(Becton Dickinson)检测荧光强度，每个标本测10000个细胞。

1.5细胞培养上清液sICAM-1含量检测

取不同处理的A549细胞培养上清液，以人sICAM-1 ELISA试剂盒(美国Ancell公司)进行检测，操作步骤按说明书进行。

2结果

2.1ATRA等对A549细胞体外增殖能力的影响

IFN α(1000 U/ml)IL-1(200 U/ml)对A549细胞体外增殖无明显影响(P＞0.05)，而ATRA(5 μmol/L)处理后，较对照组细胞增殖明显受抑制［(8.11±0.22)×10⁴/ml vs (10.15±0.56)×10⁴/ml,P＜0.01］。

2.2ATRA等对A549细胞ICAM-1、sICAM-1表达水平的影响

A549细胞ICAM-1阳性率为36.5%，经IL-1处理后表达水平明显增强(阳性率63.5%,P＜0.05)，而经ATRA处理后下降(阳性率28.2%,P＜0.05)，IFN α处理后无明显变化(阳性率38.1%,P＞0.05)。A549细胞培养上清液无法检测出sICAM-1表达(＜0.625 ng/ml)，经IFN α、ATRA处理后亦不增加sICAM-1 水平(＜0.625 ng/ml)，但经IL-1处理后，sICAM-1含量明显增高［(3.01±0.75)ng/ml,P＜0.05］。

2.3ATRA等对A549细胞体外侵袭力的影响

根据细胞穿过Matrigel胶的能力，检测不同处理的A549细胞体外侵袭力的变化。结果显示，IFN α或ATRA处理组细胞侵袭力低于对照组细胞(P＜0.05)，而IL-1处理组细胞侵袭力与对照组比较，差异不显著(P＞0.05)，见图1～4。

图1未经处理的A549细胞体外侵袭力测定(每格细胞数185.1±28.1HE×200)

fig 1The assesement of the invasiveness of untreated A549 cells in vitro

(185.1±28.1 cells per lattice HE×200)

图2经IL-1(200 U/ml)处理24 h，A549细胞侵袭力有增强趋势，但差异不显著

(每格细胞数272.6±72.3HE×200)

fig 2IL-1 (200 U/ml) treatment for 24 h increased the invasiveness of A549 cells, but no statistical significance

(272.6±72.3 cells per latticeHE×200)

图3经IFN α(1000 U/ml)处理24 h，A549细胞侵袭力降低

(每格细胞数111.4±21.1HE×200)

fig 3IFN α (1000 U/ml)treatment for 24 h decreased the invasiveness of A549 cells

(111.4±21.1 cells per latticeHE×200)

图4经ATRA(5 μmol/L)处理24 h，A549侵袭力降低(每格细胞数101.2±27.9HE×200)

fig 4ATRA (5 μmol/L) treatment for 24 h decreased the invasiveness of A549 cells (101.2±27.9 cells per latticeHE×200)

3讨论

全反维甲酸(ATRA)是体内具有重要生理活性的Vit A代谢产物之一，国内外一些报道表明：RA类化合物具有抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化及程序性死亡、抗肿瘤血管生成等特性^［3］。我们检测了ATRA、IL-1、IFNα处理的A549细胞体外增殖能力，结果显示：ATRA处理的A549细胞体外增殖明显受抑制，而IFN α、IL-1处理细胞体外增殖无明显变化，与其它报道基本一致。

粘附是肿瘤细胞侵袭转移过程中的重要环节。粘附因子介导肿瘤细胞与细胞外基质、血管内皮细胞、靶器官细胞之间的相互作用，因此与肿瘤侵袭转移行为密切相关^［1］。ICAM-1是一种细胞粘附分子，Natali等^［5］研究发现ICAM-1表达水平与黑色素瘤瘤体厚度及临床病程有很高的相关性，ICAM-1高表达的肿瘤细胞侵袭转移能力高。我们的实验结果显示：ATRA处理A549细胞后，细胞表面ICAM-1下降，而IL-1处理组ICAM-1表达增强，IFN α处理组ICAM-1表达无明显变化。其他学者^［6，7］对黑色素瘤、乳腺癌等的研究，亦发现了相似的结果。这一结果显示，由于IFN α、IL-1和ATRA对肿瘤细胞ICAM-1表达的不同作用可能导致肿瘤细胞侵袭转移行为有所不同，IL-1由于上调肿瘤细胞ICAM-1的表达而增加其侵袭转移的潜能，ATRA下调ICAM-1的表达而抑制其侵袭转移潜能。

近年来，发现<