第三军医大学学报1999年第21卷第5期

陈洁平 徐采朴林晨 张雪艳 付明 邓友平 程金科 吴旻

提要目的：研究重组RA538腺病毒对胃癌细胞的体内外生物学作用。方法：采用LacZ基因X-gal染色、MTT、克隆形成试验、DNA梯度降解试验、原位末端标记、流式细胞仪、裸鼠致瘤性、裸鼠皮下移植瘤模型实验等方法，对RA538重组腺病毒在人胃癌SGC7901细胞系中的作用进行体内外研究。结果：Ad-RA538对SGC7901细胞产生明显的生长抑制作用，MTT显示生长抑制率为76.3%。DNA梯度降解试验、原位末端标记、流式细胞仪显示Ad-RA538诱导了SGC7901细胞凋亡。经Ad-RA538处理的SGC7901细胞裸鼠致瘤性消失。Ad-ASc-myc对裸鼠皮下移植瘤模型瘤内注射能有效降低肿瘤的生长速度，生长抑制率为60.66%。结论：Ad-RA538对胃癌细胞具有显著的体内外生长抑制及凋亡诱导作用。

关键词：腺病毒 基因治疗 胃癌 维甲酸

胃癌为常见恶性肿瘤，发病率及死亡率均居我国各种恶性肿瘤的前列。探索胃癌发生发展过程中基因变异规律，寻找有效的针对肿瘤细胞的目的基因，无疑对临床胃癌的防治具有重要意义^［1,2］。抑癌基因RA538为维甲酸(Retinoic acid,RA)诱导基因^［3］。该基因能诱导肿瘤细胞终末分化、凋亡及下调c-myc基因表达^［4］。腺病毒载体的发展使基因治疗付诸于临床应用成为可能，它以遗传毒性低、致病性小、宿主范围广、滴度高、装载容量大等优势已广泛用于基因治疗^［5］ 。本课题研究腺病毒(Adenovirus,Ad)介导RA538对人胃癌细胞生物学行为的影响，探索腺病毒介导RA538治疗胃癌的可行性，为胃癌的基因治疗提供候选基因。

1材料与方法

1.1细胞系

293细胞：为腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系。培养条件为高糖DMEM培养基，含10%胎牛血清，37℃，5%CO₂。SGC7901细胞：为人胃腺癌细胞系。培养条件为M199培养基，含10%胎牛血清，37℃，5%CO₂。

1.2重组体腺病毒的制备^［6］

为E1和E3区缺失的复制缺陷型5型腺病毒载体。重组RA538及LacZ腺病毒（Ad-RA538及Ad-LacZ）均为中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物室构建。采用Ad-RA538及Ad-LacZ经鉴定为阳性的重组体腺病毒，在293细胞进行繁殖及滴度测定。提取腺病毒DNA，用一对RA538基因引物及一对腺病毒基因组引物进行PCR扩增鉴定。

1.3腺病毒转导效率测定

用重组腺病毒Ad-LacZ(含报告基因LacZ)，按25、50、100、200感染强度(Multiplicity of infection,MOI)感染细胞。X-gal染色后显微镜下观察蓝染的细胞即LacZ基因表达的阳性细胞。分别计算蓝染细胞的百分率。

1.4细胞生长曲线——MTT法

采用96孔板，每孔接种细胞5000～8000个，37℃，CO₂孵箱中培养12～24h后用病毒感染细胞。取不同时间点，弃去培养基，每孔加入MTT溶液。37℃孵育3～4h，弃去MTT溶液。每孔加入DMSD,将96孔板置水平摇床上摇动后以酶标仪在525nm波长下测定每孔D_λ值。

1.5平板克隆形成实验

每组取1个35mm培养皿，接种细胞50万个/皿。按不同滴度感染病毒，培养24h后收获细。500个/皿接种至新的60mm平皿中，每种接种3个平皿。置CO₂孵箱中培养2～3周。结晶紫染色，显微镜下计数大于50个细胞的克隆数。

1.6细胞DNA梯度降解(DNA ladder)的检测

分别收集病毒感染组及对照组细胞。 加裂解液400μl混匀。离心收集上清。加入SDS至终浓度1%，加RNA酶56℃作用2h。加入蛋白酶K37℃2h。乙醇沉淀DNA。干燥后加TE 20μl溶解DNA沉淀。琼脂糖凝胶电泳，长波紫外灯下观察并照相。

1.7细胞凋亡原位检测（TUNEL试验）

将细胞悬液滴于用多聚赖氨酸处理过的玻片上，涂匀，干燥后用多聚甲醇固定30min，取出自然干燥后按以下步骤进行：PBS洗3次，每次5min。穿透液冰上2min。PBS洗3次，每次5min。加10μlTunel反应混合液，置湿盒中，37℃，1h。PBS洗3次，每次5min。荧光显微镜下观察并照。PBS洗3次，每次5min。AP覆盖液10μl，37℃1h。PBS洗3次，每次5min。底物缓冲液50μl，室温下10～15min，苏木素复染，树脂封片。

1.8流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡

PI染色法：病毒感染细胞后分别于不同的时间点收集细胞，PBS清洗一遍。注入70%乙醇，固18h。离心弃乙醇后用PBS洗1次。加入RNA酶37℃作用1～2h。加入PI（100μg/ml）100μl混匀置冰上30min后在流式细胞仪上检测。

1.9PCR分析

PCR条件：25μl反应体系中含DNA 2μl,10×PCR buffer，15mmol/L MgCl₂,4种dNTPs各25μmol/L,加目的基因引物50pmol/L及1单位Taq DNA多聚酶，反应在PCR仪中进行。95℃预变性5min，95℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，28～30个循环后72℃延伸7min。PCR产物鉴定及定量分析：PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在长波紫外灯下观察并照相。

1.10裸鼠皮下致瘤实验

裸小鼠，品系为Balb/C, 5～6周龄，雌雄不限，由中国医学科学院肿瘤研究所动物室提供。接种SGC7901细胞于60mm培养皿中，10⁶细胞/皿，按100的感染强度分别感染Ad-RA538，Ad-LacZ及PBS，24h内消化细胞，制成10⁶细胞/0.1ml的细胞悬液。5周龄雄性裸鼠12只，随机分为4组，每组3只，分别注射Ad-RA538, Ad-LacZ及PBS各0.1ml。连续观察肿瘤出现时间和体积，时间为1个月。

1.11裸鼠皮下移植瘤模型治疗实验

收集对数生长期SGC 7901细胞，制成细胞悬液，按100μl/只量接种于裸鼠皮下。裸鼠均为5周龄鼠，共23只。雌雄各半。待肿瘤长至5mm左右时，取其中20只肿瘤体积较为均一的裸鼠，随机分为4组，每组5只。瘤体内注射腺病毒液或PBS 0.1ml,病毒液含量为10⁹pfu/只,隔日注射1次，共3次，连续观察肿瘤大小，持续1月。

1.12统计学分析

采用计算机统计程序进行χ²检验及t检验。

2结果

2.1重组体腺病毒的制备

Ad-RA538及Ad-LacZ重组体腺病毒，经293细胞繁殖后制备成病毒贮存液，于－70℃冰箱中备用。各重组体腺病毒滴度测定为Ad-RA538 3.0×10⁹ ，Ad-LacZ 3.0×10¹¹。提取各重组体腺病毒DNA，分别以腺病毒及RA538的引物进行PCR鉴定，结果Ad-LacZ可见腺病毒阳性扩增条带， Ad-RA538可见腺病毒及RA538阳性扩增条带。

2.2重组体腺病毒的转导效率

采用插入LacZ报告基因的重组体腺病毒，进行重组体腺病毒对不同细胞转导效率的检测。以Ad-LacZ按MOI 25、50、100、200的量分别感染SGC 7901细胞，48h后进行X-gal 染色显示转染效率分别为90、100、100、100。

2.3腺病毒介导Ad-RA538对胃癌细胞的生物学作用

2.3.1Ad-RA538感染后胃癌细胞的形态学变化以Ad-RA538 MOI 100的感染强度感染SGC7901细胞，第1～3天细胞聚集，变圆，胞浆内空泡增多，4～5天后逐渐浮起悬浮于培养基中。对照组细胞形态无明显变化。

2.3.2Ad-RA538对胃癌细胞生长的抑制作用①MTT试验：用MTT法对Ad-RA538、Ad-LacZ感染的SGC7901细胞生长情况进行检测，结果,见图1。Ad-RA538对SGC7901细胞生长抑制率可达76.3%（MOI 200，8d）。与Ad-LacZ组比P＜0.01。②克隆形成试验：按不同MOI 25、50、100、200的量以Ad-LacZ感染SGC7901细胞其存活率分别为89.5%，109.0%，95.8%，117.5%，Ad-RA538为88.8%，70.6%，39.9%，16.1%。说明Ad-RA538可以明显抑制SGC7901细胞的克隆形成能力及存活率。

图1Ad-RA538对SGC7901细胞生长的抑制作用(8d)

fig 1Anti-proliferative effect of Ad-RA538on SGC7901 cells(8d)

2.3.3Ad-RA538对SGC7901细胞的诱导凋亡作用①DNA梯度降解试验：提取细胞染色体DNA进行琼脂糖凝胶电泳结果发现,SGC7901细胞经Ad-RA538处理2 d后染色体DNA发生断裂,2、4、6d电泳可见180～200bp不同倍体梯状DNA(DNA Ladder),DNA Ladder的出现有一定的时间效应,以6d时明显,Ad-LacZ处理组染色体DNA未见明显的DNA Ladder。②细胞凋亡原位末端标记(TUNEL)：细胞发生凋亡时,染色体DNA在核小体之间发生断裂,形成以核小体为单位的不同长度的DNA片断,同时产生多个3-OH末端,使用末端转移酶可将标记的dUTP连接在DNA片段的3-OH末端上,进行显色,从而显示凋亡细胞。Tunel检测法发现Ad-RA538可以使SGC7901细胞出现明显凋亡。Ad-LacZ处理的细胞未见凋亡。③流式细胞仪<