第二军医大学学报1999年第20卷第5期

王清华涂来慧张仁琴

摘要目的：探讨Wasternblot法对重症肌无力合并胸腺瘤(MGT)患者的血清学诊断价值。方法：分别用蛋白印迹法和酶联免疫法检测33例重症肌无力患者（有瘤16例，无瘤17例）、正常人10例、其他疾病对照18例血清中的人骨骼肌柠檬酸提取物抗体（CAE-Ab）。结果：CAE抗原中3.4万，5.0万，6.0万组分与MGT患者血清结合显色率分别为93.7％（15/16例），75.0％（12/16例），75.0％（12/16例），而其他组无1例结合显色。蛋白印迹法、酶联免疫法对MGT患者检出阳性率分别为16/16，12/16，假阳性率分别为0/17，1/17。结论：蛋白印迹法检测血清中CAE-Ab比酶联免疫法更敏感，特异性高。但蛋白印迹法比酶联免疫法操作复杂，费用较高。

关键词：重症肌无力胸腺肿瘤印迹法，蛋白质

人骨骼肌柠檬酸提取物抗体（CAE-Ab）检测是80年代兴起的诊断重症肌无力合并胸腺瘤（MGT）的特异性较强的免疫学方法，能协助临床早期诊断胸腺瘤^［1，2］。为提高诊断胸腺瘤的阳性率，本研究应用Western blotting和ELISA法检测33例重症肌无力患者（有瘤16例，无瘤17例），正常人10例，其他疾病对照18例血清中CAE-Ab，并将结果作比较。

1材料和方法

1.1标本来源（1）重症肌无力（MG）组：1996～1997年在我院门诊及住院治疗的MG患者，根据典型的临床表现、新斯的明试验、低频重复电刺激肌电图、血清学AChR-Ab或纵隔CT、病理切片等确诊。其中手术后病理证实有胸腺瘤者16例，男9例，女7例，年龄27～70岁，平均年龄50岁；病程2个月～12年，平均4.3年。临床未发现胸腺瘤的MG患者17例，其中男8例，女9例，年龄19～79岁，平均年龄33.4岁；病程14d～20年，平均4.1年。（2）其他疾病对照组：非MG其他疾病患者共18例，男10例，女8例，年龄16～64岁。其中多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮各3例，多发性肌炎、肺癌各2例，强直性脊柱炎、周期性麻痹、运动神经元疾病、脊肌萎缩症、Eatonlambert综合征各1例。（3）正常对照组：正常人10例，男女各5例，年龄18～64岁。ELISA方法抽取了100名正常人的血液。上述各组人员均由肘静脉取血后分离血清，加适量叠氮钠防腐，置-20℃贮存待检。

1.2试剂二氨基联苯胺(DAB）Amresco公司产品。辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗人IgG，华美公司产品。丙烯酰胺、双丙烯酰胺均为Sigma公司产品。低分子质量标准蛋白上海东风生化试剂厂产品。

1.3仪器V16夹心式垂直电泳槽，上海精益有机玻璃制品仪器厂。DY-A电泳仪，中科院上海生化所申华生化技术开发公司。MltiphorⅡ电转移仪，Pharmacia Biotech公司产品。960型酶联仪，Sigma公司产品。聚苯乙烯酶联反应板，浙江黄岩化学塑料实验厂产品。硝酸纤维素滤膜Hybond-N,Amersham公司产品。

1.4方法

1.4.1CAE提取参照文献［3］方法。

1.4.2ELISA法检测CAE-Ab参照文献［2］方法，结果判定以待测血清孔D(492)值与正常对照血清D值(100例正常人混合血清)之比，求得P/N值（Patient/Normal）。

1.4.3Western blotting法检测CAE-Ab^［4,5］将CAE冷干浓缩至10mg/ml，经样品缓冲液处理后，与低分子质量marker上样于10%SDS-PAGE，每孔20μl，150V电泳2h。取下凝胶，按半干法转膜2h，电流0.65mA/cm²。取下膜剪成几条条带，封闭4℃过夜。加入1/100稀释的MGT、无胸腺瘤重症肌无力(MGNT)、正常人及其他疾病对照血清，4℃2h。漂洗后，加入HRP标记羊抗人IgG（1/100稀释）0.1ml/cm²，室温平摇2h。然后加入新鲜配制DAB/H₂O₂底物液，显色后，加入PBS液终止反应。收集滤膜条带观察分析。

2结果

2.1Western blotting法测定结果CAE抗原不同组分3.4万，5.0万，6.0万多肽区带与MGT患者血清结合率分别为93.7％（15/16），75.0％（12/16），75.0％（12/16）。然而在MGNT及单纯胸腺瘤不伴MG患者和其他疾病对照组中无1例结合。因此这些区带的结合反应具有胸腺瘤相关特异性。凡是与上述一条以上结合者则为阳性。而CAE抗原在10％SDS-PAGE上分离出十几条区带，其中10.0万，11.0万，12.5万区带组分与MG患者、正常人及部分对照疾病呈结合反应；8.4万，9.2万，9.9万组分则与16例MGT患者和2例MGNT患者及多发性肌炎患者呈结合反应；7.2万组分除与MGT患者结合外，还与多发性肌炎患者相结合。以上区带为胸腺瘤非特异性相关抗原（图1）。

图1患者血清与CAE各组分反应结果

Fig 1Sera of patients binding to ingredients of CAE

SDS-PAGE：SDS-polyacrylamide gel electrophoresis；

MGT:Myasthenia gravis with thymoma；

MGNT：Myasthenia gravis without thymoma；

N：Normal； CL：Control

2.2Western blotting法与ELISA法的比较ELISA法检测患者P/N≥2.0为阳性，MGT患者阳性率为75.0%（12/16）。Western blotting法检出MGT阳性率为100％（16/16），Western blotting法与ELISA法相比较差异显著（P＜0.05）。Western blotting法、ELISA法检测CAE-Ab假阳性率分别为0/17，1/17，相差不显著。

3讨论

本实验结果显示CAE抗原中3.4万，5.0万，6.0万多肽在大多数MGT患者中显色，而非瘤组及其他对照组中无1例显色，提示以上CAE抗原的3种组分为胸腺瘤特异相关的抗原。CAE中10.0万，11.0万，12.5万区带与MG患者、正常人及部分其他疾病患者均有结合反应。CAE中8.4万，9.2万，9.9万组分与MGT患者和2例MGNT患者及多发性肌炎患者结合。7.2万则除与MGT患者结合外，还与多发性肌炎患者结合。由此看来，这些区带组分均为胸腺瘤非特异性抗原。以往研究发现CAE作为胸腺瘤相关抗原，主要定位于心肌及骨骼肌细胞膜或膜下结构，而且在胸腺瘤上皮细胞膜上有其交叉抗原表达^［6］，而在非瘤MG患者及单纯胸腺瘤不伴MG患者胸腺及胸腺瘤上皮细胞膜上则无其交叉抗原存在，并且血清中也无CAE-Ab表达。因此CAE抗原和胸腺瘤在MG发病中起着重要作用。本研究结果进一步显示CAE中3.4万，5.0万，6.0万多肽成分可能在胸腺瘤上皮细胞膜上表达，提示MG发病时存在胸腺的免疫功能失衡。

CAE中3.4万，5.0万，6.0万区带多肽为胸腺瘤特异相关抗原，这些区带中1条以上显色即为阳性。本组检测的MGT患者16例全部阳性，非瘤组无1例假阳性。而ELISA法以CAE混合物作为抗原，检出阳性率为12/16，非瘤组17例中有1例为阳性。本结果提示，Western blotting法比ELISA法具有特异性高、灵敏度强的特点。但是Western blotting法检查操作复杂，花费较高，不能成批检查患者，因而推广应用有一定难度。当今分子克隆技术发展迅速，若能克隆出大量胸腺瘤特异性抗原，则对胸腺瘤的诊断、研究MG和胸腺瘤的发病机制具有深远意义。

作者简介：王清华，女，1972年10月生，硕士，住院医师

作者单位涂来慧张仁琴第二军医大学长海医院神经内科，上海，200433；

王清华解放军第107医院神经内科，山东烟台，264002

参考文献

1Aarli JA. Myasthenia gravis: antibodies to a cell-surface skeletal m u scle antigen and their relation to neoplastic thymic epithelioid cells. Neurolog y，1984，34(Suppl 1):241

2张仁琴，涂来慧. 应用ELISA法检测重症肌无力患者血清中胸腺瘤相关抗体. 中国神经精神疾病杂志，1991，17(4):210

3Aarli JA, Lefvert AK，Tonder O. Thymoma-specific antibodies in sera from p atients with myasthenia gravis demonstrated by indirect haemagglutination. J Neuroimmunol，1981，1(4):421

4Kuks JB, Limburg PC, Horst G, et al. Antibodies to skeletal muscle in m yasthenia gravis: part 1. Diagnostic value for the detection of thymoma. J Neuro l Sci，1993，119(2)：183

5萨姆布鲁克 J, 弗里克 E F，曼尼阿蒂斯T 著. 金冬雁，黎孟枫译. 分子克隆实验指南，第2版. 北京：科学出版社，1992. 888

6Gilhus NE, Aarli JA, Christonsson B, et al. Rabbit antiserum to a citric acid extract of human skeletal muscle staining thymomas from myasthenia gravis p atients. J Neuroimmunol，1984，7 (1) : 55