第三军医大学学报1999年第21卷第6期

丽娟 黎燕沈倍奋

提要目的：报道一种更为灵敏的细胞特异性基因转录水平分析方法。方法：用灵敏度、重复性和线性试验对该法进行评价。结果：本法可以对5×10⁵的细胞进行检测；5×10⁶的细胞受试，杂交信号强度CV值为0.11;在5×10⁵～1×10⁷细胞范围内，杂交信号强度与细胞数的线性关系较好。结论：该法灵敏度高，重复性和线性满意，可用于细胞核内新生成mRNA的分析。

关键词：细胞核 基因表达 mRNA

1978年Marzluff WF等^［1］描述了一种针对细胞核内新生成的mRNA(Newly transeribed RNA)进行分析的方法，即Nuclear runoff transcription assay，简称NRTA。由于该法依赖蔗糖梯度超速离心分离细胞核，以及靶mRNA分离纯化步骤繁琐，并未引起人们的重视。90年代后，随着细胞核及RNA纯化技术的日新月异，该技术重新得以重视并发展。我室调研了当前国外的报道，重建了NRTA，并使其灵敏度有所提高，现报道如下。

1材料与方法

1.1基本原理

NRTA的原理见图1。细胞在时间T1处经某种处理，基因A的转录水平逐渐增强，而基因B的转录水平无明显变化。在时间T1和T2收集细胞，用RT-PCR或Northern印迹技术分析基因A和基因B的转录水平时，试验提取的是细胞的总RNA，经浓度测定后，吸取少量(定量)的总RNA作为模板进行RT-PCR或使其吸附在硝酸纤维素膜上形成潜斑。在一定量的总RNA中，A基因转录产物增多，则B基因转录产物相对减少，所以，RT-PCR、Northern印迹反映的是待检基因累积性转录产物在当时总基因产物中的丰度，势必得到结论：从T1～T2基因A的转录水平是升高的，基因B的转录水平是降低的，可见基因B的描述不客观。NRTA技术在冰浴情况下立即分离的是某一“瞬时”的细胞核(要求该核与细胞质成份彻底分离而又完整无损，原有的生物学活性不受改变)，在外界只提供转录所需的NTPs的情况下，依赖原有的转录酶促系统，将核分离瞬时暂停的转录继续进行下去并至完成。收集全部的新生mRNA与已知的基因A和基因B的DNA固相探针进行反相杂交，这里要求已知的DNA探针用量足够多，能够与液相中的全部新生成mRNA杂交。试验再对该新生成的同位素标记mRNA进行检测。由于新分离的细胞核内原有已完全转录生成的mRNA量少，且原始累积性mRNA对后续实验生成的同位素标记mRNA的放射自显影检测无影响，因此，NRTA能客观反映当时核内某特定基因的转录水平，代表着当时核内催化该特定基因转录的RNA聚合酶的活性，从而真实反映了当时细胞所处的功能状态。

图1NRTA原理示意图

fig 1The diagrams of NRTA principle

1.2cDNA固相探针的制备

应用PCR制备IL-6特异性cDNA片段(500 bp)，经纯化后在90 μlcDNA水溶液中(含cDNA 600 ng)加入1mmol/L NaOH 10 μl，室温变性30 min，加入6×SSC 1 ml，冰浴中和，用6×SSC抽滤3次，每孔加入变性cDNA 100 ng，抽干，再用1ml 6×SSC清洗2次。将0.1% DEPC处理后的硝酸纤维素膜转入6×SSC浸泡2h，准备好狭缝装置，先用铅笔编号。空气过夜干燥，80°C烤2h，室温保存备用，临用前按需剪成小条。

1.3细胞核的提取

收获SKO-007细胞，立即用冰预冷的1×PBS洗涤2次，在5×10⁶细胞沉淀中加入预冷的NP-40裂解液［10 mmol/L Tris-HCl(pH7.9),100 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA, 0.5% NP-40］1.0 ml，温和混匀，冰浴10 min，4°C以500×g离心5 min，吸弃上清液。用冰预冷1×PBS同法洗涤一次，向细胞核沉淀中加入100 μl冰预冷甘油缓冲液［50 mmol/L Tris-HCL (pH8.3), 5 mmol/L MgCl₂, 100 mmol/L EDTA， 40%甘油］，用吸管轻轻吹吸混匀，立即置入-70°C备用。

1.4新生转录反应

室温解冻细胞核，立即加入100 μl2倍反应缓冲液［10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 5 mmol/L MgCl₂,300 mmol/L KCl, 1 mmol/L ATP, 1 mmol/L CTP, 1 mmol/L GTP, 5 mmol/L DTT］和100 μCi［α-³²P］UTP(购于北京亚辉生物医学工程公司，批号199704027)，轻轻吹吸混匀，立即置25°C水浴，振摇反应60 min。

1.5新生³²P标记mRNA的提取

操作同文献［3］。将得到的RNA溶于100 μlTES溶液［10 mmol/L Tris(base)(pH7.4),10 mmol/L EDTA, 0.2% SDS］中。

1.6RNA与cDNA的杂交反应

向杂交反应管补加100 μlTES/NaCl溶液［10 mmol/L Tris(base)(pH7.4),10 mmol/L EDTA,0.2% SDS,0.6 mmol/L NaCl］,混匀后放入cDNA硝酸纤维素膜条，用胶布将管盖扎紧，立即没入65°C水浴摇床中杂交36 h。取出膜条放入一个烧杯中，用25 ml 2×SSC 65°C洗膜3～4次，每次30 min。将硝酸纤维素膜投入盛1.5 ml 2×SSC/8 μl5mg/ml RNaseA的试管内，室温静置40 min。用25 ml 2×SSC室温洗膜3～4次，每次15 min。取出膜条，用透明胶将其固定在滤纸上。压片-70°C暴光3～4d，放射自显影后，用激光扫描仪测相对杂交信号强度。

2结果

2.1灵敏度

用1×10⁵细胞实验即可得到肉眼可分辩的阳性杂交性号，5×10⁵以上的细胞阳性杂交信号明确，见图2。

图2灵敏度试验结果

Fig 2The results of sensitivity test by the same group cultured SKO-007 cells

用5×10⁴～5×10⁶同批稳态培养的SKO-007细胞进行试验，结果5×10⁵细胞阳性杂交信号明确。

2.2重复试验

将同批收获的SKO-007细胞等分成10份，每份5×10⁶细胞，结果杂交信号强度为(10.00±1.12)%，CV值0.11，见图3。

图3重复性试验结果

Fig 3The results of repeativity test by 10 portions of the same group cultured SKO-007 cells at 5×10⁶

用10份同批培养的5×10⁶ SKO 007细胞试验，结果杂交信号强度相差不大。

2.3线性范围

细胞数在5×10⁵～1×10⁷范围内随着细胞用量的增加杂交信号加强，线性良好，见图4。

图4线性试验结果

Fig 4Relationship between cell quantity and relative signal intensity of hybridization

3讨论

NRTA在近年国外一些有关的文献报道中已有不少应用的实例，其实验方案大体一致，只是在细胞核提取和同位素标记mRNA的提取方法上有一些差异。值得注意的是：细胞核的提取是NRTA技术的关键步骤，直接影响新生转录中³²P标记RNA的掺入率。国外文献报道的核提取方法较多，如蔗糖梯度超速离心法^［1］、Donuce匀浆法^［4］、低渗缓冲液裂解法^［5］，NP-40裂解法^［2］等。其中NP-40裂解法操作简单、快速 ，为当前大多数学者采用，我们将配方中Tirs-HCL的pH调至7.9，将NaCl浓度调至100 mmol/L，用0.5%NP-40经冰浴5 min的反应，细胞裂解彻底，所收获的核胞质成份去除彻底，体积无明显改变，核膜完整，核仁清晰，实验最终得到的杂交信号最强。

新生成mRNA的提取是影响方法灵敏度的重要环节。大多数文献采用AGPC法^［6］，也可见盐酸胍/氯化铯法^［8］，以及以tRNA为载体的蛋白酶K/TCA沉淀法^［1］。我们将细菌RNA制备用的SDS/Phenol法改进后用于新生mRNA提取，实验结果满意^［3］。

另外，国外文献报道的新生转录反应温度为42°C，反应时间30～40 min，(1～5)×10⁷的细胞［α-³²P］UTP用量在50～250μCi。我们的研究提示：最佳反应温度应为25°C，反应时间60 min， 5×10⁶的细胞［α-³²P］UTP用量为100μCi。同时，我们用PCR克隆和经纯化的cDNA片段代替全质粒探针实验，经上述处理后，使方法的灵敏度提高了十倍，受试细胞数(1～5)×10⁷下调至(1～5)×10⁶。

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