第二军医大学学报1999年7月第20卷第7期

刘彦君王华菁刘小萍周倩卢洋王皓卫立辛郭亚军

摘要目的: 克隆人IL-12的cDNA。方法：利用RT-PCR从人NC 37淋巴母细胞中克隆出IL-12中两个亚基p35和p40的cDNA并进行序列测定。结果：从NC 37细胞中克隆的p35 cDNA序列(GenBank登录号为AF 101062)与先前登录在GenBank上的M65271 (NC 37细胞来源）和M 65291(RPMI 8866细胞来源,美国专利号：5648467）的p35 cDNA序列分别有2处和1处碱基不同：编码第44位氨基酸残基密码子的第3个碱基M 65291是C，而M 65271和本研究AF 101062的相应序列2是G；编码第244氨基酸残基密码子的第3个碱基，M 65271序列是C，而M 65291和AF 101062的相应序列是T；编码第247氨基酸残基密码子的第2个碱基M 65271序列是C，而M 65291和AF 101062的相应序列是T。此外，本研究克隆的p40 cDNA序列与登录在GenBank的p40 cDNA (M 38444)序列完全相同。结论：尽管本研究克隆的p35 cDNA序列与已知的两种p35 cDNA序列分别有2处和1处碱基不同，但其编码的氨基酸序列却与专利登记的p35 cDNA（M 65291）编码的氨基酸序列完全一致,表明克隆的IL-12基因所表达的蛋白质在理论上是符合目前药用标准的。

关键词：白介素12cDNA聚合酶链式反应

IL-12在机体免疫调节中发挥十分重要的作用，IL-12对NK细胞和T细胞具有多重生物效应^［1～3］。在动物模型中，IL-12具有明显的抗肿瘤、抗感染作用^［3］。为进一步研究人IL-12在疾病治疗中的作用，我们拟克隆人IL-12中的p35和p40 cDNA。

1材料和方法

1.1材料人NC 37淋巴母细胞, 购自ATCC。本实验使用的限制性内切酶、逆转录试剂盒、抽提总RNA和mRNA的试剂盒均购自Promega公司。高忠实性PCR系统购自Boehringer Mannheim公司。细胞培养液RPMI和DMEM、胎牛血清、青霉素、链霉素均购自Gibcol BRL公司。Calcium ionophore A 23187和Phorbol 12-myristate 13-acetate购自Sigma公司。Script ^TMAMP SK(+) PCR试剂盒购自Strategy公司。测序反应试剂盒购自Perkin Elmer公司。测序反应产物纯化柱购自Pharmacia公司。全自动DNA测序仪系Perkin Elmer公司ABI Prism 310型。

1.2方法

1.2.1抽提NC 37细胞的mRNA将人NC 37淋巴母细胞于RPMI 1640/DMEM (1∶1)培养液中培养，其中含10%胎牛血清、25 ng/ml calcium ionophore A 23187,10 ng/ml Phorbol 12-myristate 13-acetate,100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素。在37℃,7.5% CO₂的孵箱中培养96 h后，取5×10⁶个细胞；采用Promega公司的纯化总RNA和mRNA的试剂盒提取其mRNA。

1.2.2RT-PCR扩增IL-12 cDNA取0.48 μg (3 μl) 上述mRNA，8 μl 25 mmol/L的MgCl₂，4 μl 10×逆转录缓冲液，4 μl 10 mmol/L dNTP，1 μl RNA酶抑制剂，1.5 μl AMV逆转录酶（37.5 U），2 μl Oligo(dT)₁₅引物(1 μg)，最后加入16.5 μl水，使终体积到40 μl。将上述混合物于48℃反应45 min，然后各取20 μl上述反应物分别做PCR以克隆IL-12中的p35和p40 cDNA。扩增p35的引物是：5′ GAC GCG GCC GCC TCG GGA CAA TTA TAA AAA TGT GG 3′和5′GAC GGT ACC GAC CTC GCT TTT TAG GAA GCA 3′ ；扩增p40的引物是：5′ GAC GGA TCC GCC CAG AGC AAG AATG TGT CAC 3′ 和5′ GAG GGA TCC TGG ATC AGA ACC TAA CTG CAG GGC 3′。PCR反应采用高忠实性PCR系统：反应体积均为80 μl，其中含上述逆转录反应物20 μl，引物各1 μl，10×PCR缓冲液6 μl及51 μl的水；在94℃热启动5 min后，加入1 μl（3.5 U）高忠实PCR酶(Taq/Pwo)；PCR条件是94℃ 45 s,60℃ 1 min,72℃ 1 min，共35个循环，最后延长反应为72℃ 7 min^［4］。

1.2.3PCR片段与Script ^TMAMP SK(+)载体的连接和转化反应取PCR-Script Cloning Vector 1 μl (10 ng/μl)，10×连接缓冲液1 μl，10 mmol/L rATP 0.5μl, Srf限制性内切酶1 μl (5 U) , T4连接酶1 μl (4 U) , 最后加入纯化的PCR片段5.5 μl, 室温下孵育1 h。然后将反应物于65℃水浴10 min。随即转化感受态细菌JM 109，转化后的菌铺于含X-Gal (20 mg/ml),IPTG (200 mg/ml) 和氨苄青霉素（100 μg/ml）的LB板上。12 h后，挑选白色菌落，小样扩增后抽提质粒，酶切鉴定目的cDNA是否已经插入Script ^TMAMP SK(+)载体：鉴定p35用Not Ⅰ 和Kpn Ⅰ 酶，鉴定p40用Bam H Ⅰ 酶。

1.2.4p35 cDNA和p40 cDNA的序列测定将Qiagen公司Plasmid Mid Kit纯化的上述含p35和p40 cDNA的质粒，加入到Perkin Elmer公司的测序试剂中进行测序反应：分别取0.42 μg p40 cDNA-Script^TM SK(+)质粒 (1.1 μl) 和0.42 μg p35 cDNA-Script^TM SK(+)质粒 (2.5 μl) 作为模板，加入8 μl Terminator Ready Reaction Mix, 3.2 pmol测序引物（1 μl），加水至20 μl。p35和p40 cDNA的两端测序引物采用PCR-Script^TM SK(+)质粒中多克隆位点两侧的通用引物T7 (5′GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3′) 和T3（5′AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG 3′），p35 cDNA中间测序引物序列是5′ACC AGC ACA GTG GAG GCC TGT 3′，p40 cDNA中间测序引物序列是5′GGA AGA TGG AAT TTG GTC CAC 3′。测序反应条件：96℃ 30 s；50℃ 15 s；60℃ 4 min；25个循环。利用Pharmacia公司的纯化柱纯化此测序反应物，然后将纯化后的样本通过ABI PRISM自动测序仪测序。

2结果

2.1RT-PCR扩增IL-12 cDNA的结果RT-PCR扩增产物经DNA凝胶电泳鉴定（图1），发现扩增的片段特异性强，大小与预计的长度相吻合

图 1从NC 37细胞中RT-PCR所得的

p35和p40 cDNA片段

Fig 1RT-PCR fragments of p35 and

p40 cDNA from NC 37 cells

M₁ : 100 bp ladder DNA marker; M₂: 1 kb DNA marker

（p40 cDNA为1 027 bp，p35 cDNA则为812 bp）。

2.2p35-Script ^TMAMP SK(+)和p40-Script ^TMAMP SK(+)阳性克隆的筛选分别从p40, p35 cDNA与Script ^TMAMP SK(+)连接产物转化的菌板中挑选2个和3个白色菌落。对p40-Script ^TM AMP SK(+) 酶切（BamH Ⅰ）显示：2个白色菌落抽提的质粒中有一个是已插入p40 cDNA的阳性质粒；对p35-Script ^TMAMP SK(+)质粒酶切（Kpn Ⅰ和Not Ⅰ）的结果发现：3个白色菌落抽提的质粒中有两个是已插入p35 cDNA的阳性质粒（图2）。

2.3p40和p35 cDNA的序列测定结果分别取上述1号p35 cDNA和1号p40 cDNA克隆，进行序列测定，p35 cDNA 的测序结果见图3。

图中*显示从NC 37细胞中克隆的p35 cDNA序列与登录在GenBank NC 37（M 65271）和RPMI 8866 （M 65291）细胞来源的p35 cDNA序列分别有

图 2酶切鉴定p40 cDNA/Script^TMAMP SK(+)和p35 cDNA/Script^TMAMP SK(+)的阳性克隆

Fig 2Identification of p40 cDNA/Script^TMAMP SK(+) and p35 cDNA/ Script^TM

AMP SK(+) vector by restriction enzymes

M₁：500 bp ladder DNA marker; M₂：100 bp ladder DNA marker

图 3p35 cDNA序列测定结果

Fig 3The result of p35 cDNA sequence

2处和1处碱基不同：编码第44位氨基酸残基密码子的第3个碱基M 65291是C，M 65271和本研究克隆的相应序列是G，所对应编码的氨基酸未变，均是缬氨酸；编码第244氨基酸残基密码子的第3个碱基，M 65271序列是C，M 65291和本研究克隆的相应序列是T，对应编码的氨基酸残基未变，均是天冬氨酸；编码第247氨基酸残基密码子的第2个碱基M 65271序列是C，对应氨基酸残基为苏氨酸，M 65291和本研究克隆的相应序列是T，对应氨基酸残基是甲硫氨酸。

总之,本研究克隆的p35 cDNA序列所编码的氨基酸序列与专利登记的p35 cDNA（美国专利号为5648467，在GenBank是M 65291）编码的氨基酸序列完全一致。针对这一结果，我们重复2次RT-PCR，从NC 37细胞的mRNA中扩增p35 cDNA片段，随后进行DNA序列测定，重复测序的结果仍与本研究第一次测定的p35 cDNA一致。本研究克隆的p40 cDNA这一序列与登录在GenBank上的p40 cDNA序列（M 38444）完全一致。

3讨论

本研究