第三军医大学学报1999年第21卷第5期

宋建勋朱锡华陈克敏

提要目的：分析确定人Fas(H-Fas)抗原具有死亡效应的表位区域。方法：采用可及性方案、可塑性方案，结合抗原性方案、二级结构方案预测H-Fas抗原B细胞表位。Fmoc固相合成法合成部分预测表位肽段并鉴定后，经固相ELISA确定是否与具有诱导细胞凋亡(PCD)的抗人Fas mAb

2Al、DX₂、CH-11反应。结果：H-Fas抗原胞外区的B细胞表位可能位于N-末端氨基酸(AA)残基51～

78，102～110，145～157等区域内或它们附近。用Fmoc固相合成法合成N-末端AA残基2～15，50～

83肽段，毛细管电泳鉴定合成效率，AA序列分析仪检测合成序列组成正确后，经固相ELISA法检测，抗人Fas mAb 2A1、DX2、CH-11均不识别N-末端100个AA内肽段。结论：H-Fas抗原死亡表位可能界定在100～157区域。

关键词：Fas抗原表位细胞凋亡死亡信号

Fas抗原是现今已知的细胞膜表面具有诱导细胞凋亡能力最重要的分子之一，又称“死亡分子”，与“存活分子”Bcl-2相互拮抗，成为近年细胞凋亡领域研究的一对热点^［1］。抗Fas单克隆抗体(mAb)或Fas配体(FasL)与Fas抗原结合可以诱导Fas⁺敏感细胞的凋亡。Fas抗原与抗Fas mAb或

FasL结合后引起Fas抗原胞内区死亡域交联，启动死亡信号的传导，其传导可能与蛋白激酶、蛋白

酶、神经酰胺、Ca²⁺等有关^［2］。传导途径与肿瘤坏死因子受体(TNFR)不同，受到多方面调控，包

括：①蛋白激酶及蛋白磷酸酶的磷酸化、去磷酸化调节；②Fas抗原死亡信号中的蛋白酶调控，又

包括转录水平调节、翻译后修饰及其它调变剂的相互作用；③Bcl-2、Bcl-X_L等的拮抗凋亡作用等

^［3］。Fas抗原表位与信号传导关系密切，不同的表位启动的信号传导效果有差异，其中有的表位

是启动死亡信号传导所必需^［4］。抗人Fas mAb 2A1、DX2、CH-11能诱导Fas⁺敏感细胞凋亡，那

么，其所识别的H-Fas抗原胞外区表位与死亡信号传导必定相关。明确能诱导Fas⁺敏感细胞凋亡的

Fas抗原表位对于Fas抗原信号传导机制的研究，尤其是死亡信号传导的早期事件具有重要意义。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1多肽合成用试剂Fmoc-氨基酸、HMP-树脂、哌啶等均为PE公司产品。

1.1.2抗体鼠抗人Fas mAb 2A1(自制，IgG₁)，鼠抗人Fas mAb CH-11(Kamiya,IgM,我室访美

学者郑力新赠送)，鼠抗人Fas mAb DX2(PharMingen,IgG₁)，HRP-羊抗鼠IgG(华美)，小鼠IgG、IgM

对照(华美)。

1.1.3抗原可溶性重组人Fas标准蛋白(SrFas,Phar-Mingen)。

1.1.4主要仪器多肽合成仪：ABI 431A(Applied Biosystems)；毛细管电泳仪：CE300

(Bio-Rad)；氨基酸序列分析仪：121MB型(Beckman)；酶联检测仪：Model 3550(Bio-Rad)。

1.2方法

1.2.1H-Fas抗原胞外区AA序列根据Itoh等^［5］(1991)及Oehm等^［6］(1992)克隆的人细胞表面

fas抗原cDNA基因序列推导得知。

Sequence:H-FAS(extracellular domain)

Sequence length 157 Residues

图1H-Fas抗原胞外区AA序列

fig 1AA sequence of human Fas extracellular domain

1.2.2可及性方案和可塑性方案的预测方法采用Goldkey软件(北京军事医学科学院吴加金等编制)，把H-Fas抗原胞外区AA序列输入第一工作区，用7个AA这一组的分析参数。两种方案的各残基指数参照文献全部在计算机上进行，高于阈值的峰为预测出的位点。

1.2.3H-Fas多肽的顺序选择及化学合成根据对H-Fas抗原B细胞表位的预测结果，选择H-Fas抗原N-末端AA残基2～15，50～83作为合成肽序列，并命名为P14，P34，序列如下：

P14：NH₂-LSSKSVNAQVTDIN-COOH

P34：NH₂-GERKARDCTVNGDEPDCVPCQEGKEYTD

KAHFSS-COOH

P14主要是作为P34合成的对照。用Fmoc固相合成法在Applied Biosystems 431A多肽合成仪上

进行。成肽反应用DCC/HOBt法，肽链从C端向N端延伸。经保护肽树脂合成，切割与脱保护，分离与

纯化获得P14，P34合成产物。

1.2.4H-Fas多肽合成产物鉴定取少量多肽样品行毛细管区带电泳(CZE)，电泳条件为：电泳缓冲液为0.1mol/L磷酸钠缓冲液，pH4.5，毛细管规格为48cm×50μm，真空进样1.0s(20Psi)，电压

10kV，电流10μA，整合波长200nm,电泳方向从正极到负极。另取少量多肽样品经6mol/L HCl酸解

后，用Beckman 121MB型AA序列分析仪进行AA组成分析。

1.2.5酶联免疫吸附测定(ELISA)按常规固相ELISA方法。简言之，用包被缓冲液(0.85mol/L、pH7.6碳酸钠缓冲液)将合成肽P14、P34稀释至40μg/ml，包被96孔酶联检测板(Corning)，100μl/孔，37℃，水浴1h。弃去孔内液体，用洗涤缓冲液(pH7.4PBS)洗涤，拍干。等量SrFas包被酶联板作为对照。分别加入鼠抗人Fas mAb 2A1、DX2、CH-11及正常小鼠Ig对照

100μl/孔(1∶40稀释)，37℃，水浴1h，同上洗涤、拍干。加HRP酶标第二抗体100μl/孔(1∶50稀

释)，置37℃，水浴1h，同上洗涤、拍干。加新鲜配制的0-邻苯二胺(OPD)-H₂O₂底物液，显示。于

酶联检测仪上测定各孔490nm处的D_λ值。

2结果

2.1可及性方案和可塑性方案的预测结果

N-末端AA残基第4～38，45～55，58～62，68～81，93～94，102～108，142～154为可及性区域，以50、75、105、155残基附近可及性程度为高，可能位于H-Fas抗原表面，见图2。N-末端AA残基4～5，14～18，22～34，47～54，60～63，69～74，81～82，102～11，14～154为可性区域，以

50、10、155残基附近可塑性程度为高，可能具有一定柔韧性，见图3。

2.4固相ELISA鉴定

虽然抗人Fas mAb 2A1、DX2、CH-11均识别SrFas蛋白，但它们均不与合成肽P14、P34反应，

IgG、IgM对照均为阴性结果，见图5。说明抗人Fas mAb 2A1、DX2、CH-11所识别的Fas表位均不P34

肽段内。

图2人Fas抗原可及性预测

fig 2Accessibility prediction of H-Fas

图3人Fas抗原可塑性预测

fig 3Flexibility prediction of H-Fas

2.2H-Fas B细胞表位预测结果

综合上述2个方案的预测结果，结合抗原性预测、二级结构预测及表位预测方法结果，得出

h-Fas抗原的B细胞表位可能位于N-末端AA残基51～78，102～110，145～157区域或它们附近(未考虑糖链的影响)。

2.3P14、P34多肽合成

两种多肽合成产物经AA序列分析仪测定后，其序列组成与选择顺序相同。毛细管电泳后经微积分显示其合成效率P14为30.13%，P34为83.26%，见图4。

图4合成肽毛细管区带电泳分析结果A. P14B. P34

Fig 4Analysis of synthetic peptides by capillary zone electrophoresisA. P14B. P34<