第三军医大学学报1999年第7期

王征旭^何振平李春海^冯东晓^王鑫^孔繁华

提要目的：研究人IFN-γ基因对胆管癌细胞株免疫原性的影响。方法：构建携带人IFN-γ cDNA的逆转录病毒载体pZIP-IFN-γ，导入人胆管癌细胞系QBC939，运用Western Blot法分析MHCⅠ类分子的表达，体外混合淋巴细胞、肿瘤细胞培养(MLTR)和淋巴细胞杀伤试验研究导入IFN-γ基因的QBC939细胞免疫原性的变化。结果：G418阳性QBC939-IFN-γ细胞分泌IFN-γ活性为每48 h 0～9.5 IU/10⁶, Southern Blot和Slot Blot 证实了目的基因的整合及表达。Western Blot证明MHCⅠ类分子表达水平是未转基因亲本瘤细胞的1.78倍。MLTR证实该瘤苗能明显刺激胆管癌病人外周血淋巴细胞的增殖，并能增强HLA A2 位点相匹配的胆管癌病人外周血淋巴细胞的杀伤活性。结论：IFN-γ基因修饰瘤苗能增强胆管癌细胞系QBC939 的免疫原性。

关键词：胆管癌细胞系基因治疗干扰素-γ肿瘤疫苗免疫原性

肿瘤生物治疗是当今恶性肿瘤四大主要疗法之一，且越来越引起人们的重视。如何提高肿瘤的免疫原性，增强机体特异性细胞毒性T淋巴细胞的杀伤活性，是当今肿瘤免疫基因治疗领域的主要课题之一^［1］。本研究以逆转录病毒载体介导，将人干扰素-γ(IFN-γ)基因导入胆管癌细胞系,研究该基因修饰瘤苗免疫原性的改变。

1材料与方法

1.1逆转录病毒载体的构建及导入包装细胞系

质粒pGEM-1-IFN-γ携带人IFN-γcDNA，长1.1Kb，克隆到逆转录病毒载体pZIP.Neo.SV(x)1的BamHI位点上，受5′-LTR控制，构成pZIP-IFN-γ。将此重组载体用Lipofectamin (GIBCO)介导，导入单向性逆转录病毒包装细胞系Ψ-2细胞，经G418(GIBCO) 筛选，克隆细胞上清感染双向性逆转录病毒包装细胞系PA317细胞，G418筛选，收集培养上清，存－80°C。

1.2靶细胞的感染及靶细胞培养上清IFN-γ的活性测定

将上述培养上清感染胆管癌细胞系QBC939(本科室王曙光博士建立并惠赠)，G418 筛选阳性克隆并扩增培养。用干扰素的抗病毒活性来检测IFN-γ的生物学活性。VSV（水泡性口炎病毒）和WISH细胞由军事医学科学院五所王汝懿教授提供。

1.3DNA、蛋白杂交及PCR分析

提取含目的基因克隆细胞DNA、RNA，用地高辛标记（Boehringer Mannheim) IFN-γ基因片断，进行Southern Blot和Slot Blot。PCR法扩增克隆细胞基因组中新霉素抗性基因(Neo 基因)的特异性序列，扩增片段长433bp,引物序列：上游引物：5’-TCCATCATGGCTGATGCAATGCGGC-3’,下游引物：5’-GATAGAAGGCGAT GCG CTGCGAATCG-3’。提取培养细胞蛋白质，行Western Blot。鼠抗人HLA-ABC单抗购自华美公司（1∶50稀释），HRP-标记兔抗鼠IgG（1∶1500稀释）由军科院肿瘤分子生物学室自建，显色底物为二氨基联苯胺（DAB）。杂交结果用激光扫描仪进行定量分析。

1.4混合淋巴细胞、肿瘤细胞培养（Mixed lymphocyte and tumor cell reation,MLTR）^［2］和淋巴细胞杀伤功能实验^［3］

取胆管癌病人外周血，用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，培养2 h以去掉贴壁的单核细胞，未贴壁的淋巴细胞与QBC939-IFN-γ细胞或QBC939细胞(均用5000rads ⁶⁰Coγ线照射)共同培养5 d，³H-TdR(中国原子能研究院)渗入法测培养细胞的Bq值。胆管癌病人外周血淋巴细胞及QBC939细胞均用微量淋巴细胞毒法进行HLA分型（上海市血液中心产血清盘）。HLA A2位点相匹配者行CTL杀伤实验，效应细胞为已培养7 d的胆管癌病人外周血淋巴细胞，靶细胞为未转基因的QBC939细胞，采用MTT (Fluka)比色法测定。

1.5统计学处理

采用t检验。

2结果

2.1重组逆转录病毒载体的酶切鉴定

重组质粒用BamHⅠ酶切，产生1.1 kb和10.2 kb两个片断，表明重组连接成功。用HindⅢ酶切重组质粒，产生3.2 kb和8.1 kb两个片断，分离回收含IFN-γcDNA的3.2 kb片断，再用BglⅠ不对称酶确定连接方向，正向连接应出现2.25 kb和0.95 kb两条带，电泳示重组符合正向连接，见图1。

图1IFN-γ重组逆转录病毒载体的酶切鉴定

Fig 1Enzymatic assay of recombinant retroviral

vector conclude IFN-γ cDNA

M:λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ Markers; 1: pZip-IFN-γ/HindⅢ; 2:pZip-IFN-γ; 3: pZip-IFN-γ/BamHⅠ; 4: pZip-IFN-γ/HindⅢ /BglⅠ

2.2培养上清IFN-γ活性测定及DNA、蛋白杂交和PCR

PA317-IFN-γ培养上清感染QBC939后，经G418筛选，挑选24个克隆，并扩增培养，测48 h培养上清IFN-γ活性，结果最高为每48 h 9.5 IU/10⁶(明显低于肝癌细胞系HepG2)。Southern Blot显示目的基因已整合到靶细胞基因组DNA上，PCR可见靶细胞基因组中逆转录病毒载体Neo基因的表达。Western Blot证明转IFN-γ基因的瘤苗MHC Ⅰ类抗原表达水平增高，其杂交密度是亲本瘤的1.78倍，见图2。

图2Western Blot结果分析

Fig 2Result of Western Blot assay

1: Introduced IFN-γ cDNA; 2: Introduced

IL-2 cDNA; 3: Parent cell

2.3MLTR和淋巴细胞杀伤功能试验结果

MLTR分析7例胆管癌病人外周血，用QBC939-IFN-γ刺激培养后，Bq值均升高（P＜0.01)。经微量淋巴细胞毒试验，QBC939细胞系的HLA分型为A2,10 B51(5),12, 7例胆管癌病人，有6例存在HLA A2位点，其中4例出现淋巴细胞裂解活性升高(P＜0.01)，见图3。

图3导入IFN-γ基因后PBLC裂解靶细胞活性改变

Fig 3PBLC lystic activities assay after transduced

by IFN-γ gene

3讨论

疫苗主要是用于疾病的预防，而肿瘤疫苗的治疗对象则是已患肿瘤的病人，用于治疗术后转移、复发，及术中无法清除的残留灶。目前国际上用于肿瘤疫苗研究的基因中，公认为导入IL-2、IFN-γ、GM-CSF、B7基因的治疗效果最佳^［4］，其中IFN-γ的基因治疗，近年来越来越引起人们的重视^［5］。到1996年底世界上共批准了1430例肿瘤基因治疗病例^［6］，其中利用IFN-γ基因治疗的病例为168例，占11.75%。导入IFN-γ基因可以①诱导肿瘤细胞MHC Ⅰ Ⅱ类分子的表达^［7］；②防止接种的瘤苗过早被机体非特异性免疫系统所排斥^［8］；③IFN-γ的直接杀瘤细胞作用；④与其它细胞因子协同抗肿瘤作用^［9］。胆管癌目前发病率有上升的趋势，且一旦发现多为晚期，病死率高，愈后极差，临床急需新的治疗方法。我们以胆管癌为研究对象，构建了含人IFN-γ基因的逆转录病毒载体，并能有效整合到胆管癌细胞基因组中，且持续分泌一定浓度的IFN-γ。该基因修饰的瘤苗MHCⅠ类分子的表达水平，是未转基因亲本瘤的1.78倍。将已致敏胆管癌病人外周静脉血淋巴细胞与该瘤苗共同培养，能明显刺激淋巴细胞的增殖反应，且诱导胆管癌病人外周血淋巴细胞的杀伤活性增强，6例HLA A2阳性病人，有4例淋巴细胞杀亲本瘤细胞的作用升高（P＜0.01）。

我们的研究认为：IFN-γ基因修饰的胆管癌瘤苗，能增强胆管癌的免疫原性，并刺激机体淋巴细胞的增殖和增强外周血淋巴细胞裂解肿瘤细胞的活性，具有潜在的临床应用前景。

*王征旭，男，34岁，主治医师，博士，现在第二军医大学东方肝胆外科医院上海，200433

**军事医学科学院附属医院肿瘤分子生物学室北京，100000

***军事医学科学院基础医学研究所北京，100070

****军事医学科学院附属医院免疫室北京，100000

作者单位：王征旭^何振平李春海^冯东晓^王鑫^孔繁华第三军医大学附属西南医院肝胆外科中心 重庆,400038

参考文献

1王征旭，何<