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提要目的：调查P16基因是否与原发性肝细胞性肝癌(PHCC)的发生有关。方法：采用多重PCR分析法、单链构象多态性(Single strand conformation polymorphism,SSCP)分析法及以PCR为基础的甲基化分析法对25例原发性肝细胞性肝癌(PHCC)标本及其相应的非肿瘤肝组织标本中P16基因的缺失、点突变及甲基化情况进行检测。用免疫组织化学法对35例(包括前述已作基因检测的25例)原发性HCC肿瘤标本及其相应的非肿瘤组织标本中P16蛋白的表达情况进行了调查。结果：25例HCC肿瘤标本中，3例有P16基因缺失，其中2例为纯合子缺失，1例为半合子缺失。另发现1例P16基因无缺失者有D9s162缺失。无P16基因缺失的22例肿瘤标本中均未发现有P16基因点突变存在。肿瘤标本中基因的甲基化发生率为24%(6/25)，而全部非肿瘤组织均未出现P16基因甲基化。在35例HCC肿瘤标本中发现P16蛋白表达缺失16例(45.7%)，而全部非瘤组织P16蛋白均表达阳性。P16蛋白表达缺失与肿瘤的病理分级有关，分级高者(Ⅲ、Ⅳ级)比分级低者更易发生(P＜0.01)。在25例作了P16基因检测的肿瘤中，3例有P16基因缺失及6例有P16基因甲基化者，全部表现P16蛋白表达缺失，另有3例未检出P16基因异常者也发现有P16蛋白表达缺失。结论：P16基因的失活与P16蛋白表达的丧失与原发性肝细胞性肝癌的发生及发展有关。
关键词：肝癌P16基因聚合酶链反应免疫组织化学
现已知道，P16基因的异常改变发生在许多肿瘤中，包括黑色素瘤，胰腺癌，食管磷状细胞癌，脑肿瘤及造血系统肿瘤等［1，2］。P16基因的失活机制较多，包括基因缺失，点突变及5′CpG岛高甲基化［1，3］，不管其失活机制如何，最终将表现为P16蛋白表达缺失。因为P16蛋白在细胞周期中起负性调节作用，P16基因的失活可能是导致细胞生长失控并癌变的主要因素之一。虽然已有几个研究小组报道了P16基因在HCC中的作用地位。然而不同国家的报道结果差异较大［4，5］。本文报道中国西南地区人群中原发性肝细胞性肝癌中P16基因的状况与P16蛋白的表达。
1材料与方法
1.1组织标本
35例原发性肝细胞性肝癌(Primary hepatocellular carcinoma,PHCC)肿瘤标本及其相应的非瘤肝组织标本均为华西医科大学外科手术切除标本。按Edmonson与Steiner标准进行分级，其中Ⅰ级3例，Ⅱ级17例，Ⅲ级11例，Ⅳ级4例。全部标本均用免疫组织化学法作P16蛋白表达的检测，其中25例用作P16基因异常改变的检查，DNA的提取按标准方法进行。
1.2比较多重PCR分析
将P16基因第1与第2外显子分别与用作内对照的微卫星多态性双核苷酸重复序列D9S162同时扩增，引物的设计参照文献［6］，其序列及PCR产物片断大小如下：
p16第1外显子5′GAAGAAAGAGGAGGGGCTG3′
5′GCGCTACCTGATTCCAATTC3′
(340 bp)
P16第2外显子5′GGAAATTGGAAACTGGAAGC3′
5′TCTGAGCTTTGGAAGCTCT3′
(509 bp)
D9S1625′GCAATGACCAGTTAAGGTTC3′
5′AATTCCCACAACAAATCTCC3′
(172～196 bp)
PCR反应体积为25 μl，反应混合物含10 mmol/L Tris(pH8.3)，1.5 mmol/L MAgcl2，50 mmol/L KCl,200 μmol/L dNTPs,5% DMSO;1.0 UTaq聚合酶(BoeringerMannheim，德国)，1 μmol/L引物，100 ng DNA模板。PCR反应条件为，95℃预变性5 min后，按如下参数循环，95℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸30 s，循环30次后，72℃再延伸5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，用Bio-Rad公司的GS-250 Molecular analysis程序使PCR产物条带在计算机上显像并计算P16与D9S162条带密度比。若肿瘤组织中该密度比为用作对照的非肿瘤肝组织的10%以下或50%以下，则分别判为P16基因纯合子缺失或半合子缺失。
1.3SSCP分析
对未发现P16基因缺失的肿瘤标本作SSCP分析，检测P16基因第2外显子突变(许多肿瘤中P16基因突变95%以上发生在第二外显子)。PCR反应条件同前，PCR产物经10 U限制性内切酶SmaⅠ(Boeringer Mannhiem,德国)25℃消化8h，取6μl消化产物加入15 μl变性缓冲液中，96℃变性10 min，冰上骤冷。行非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳，室温1.5 W过夜。采用银染法显示凝胶中DNA单链条带。
1.4以PCR为基础的甲基化分析
参照已发表的文献，采用PCR法检测位于5′CpG岛(富含GC的区域)内P16基因第1外显子的甲基化情况，先用甲基敏感的限制性内切酶SmaⅠ消化1μg基因组DNA。SmaⅠ在P16基因第1外显子内有1个酶切位点，当该位点未甲基化时，将被SmaⅠ切断。用10 U SmaⅠ在25℃消化8h后，再用10 U SmaⅠ消化过夜，以保证模板的彻底消化。以消化好的基因组DNA作模板，按前述方法同时扩增P16基因第1外显子与内对照D9S162(不含SmaⅠ酶切位点)。PCR产物行1.8%琼脂糖凝胶电泳。
1.5免疫组化分析
采用免疫组化LSAB法，对35例肿瘤标本及其相应的非肿瘤标本中P16蛋白的表达进行检测。标本经福尔马林固定，石膜包埋，4μm切片，铺在0.02% poly-1-lpsine打底的载玻片上。
免疫组化染色按药盒说明书进行，第一抗体为兔抗人P16多克隆抗体(SantaCaruz公司)，稀释度1∶100。以PBS代替-抗设立阴性对照，用已知的P16蛋白表达阳性的乳癌组织作阳性对照。显微镜下观察，以阳性着色细胞数＜10%为阴性。
2结果
2.1P16基因的缺失频率
在25例肿瘤标本中，共发现3例P16基因第1外显子与第2外显子缺失，缺失率为12%。其中纯合子缺失2例，半合子缺失1例。1例未发现P16基因缺失的肿瘤标本显示D9S162缺失。图1显示一组有代表性的DNA样品中P16基因第2外显子与D9S162多重PCR扩增的结果。6、8泳道肿瘤标本P16基因第2外显子密度明显减低，几至消失。判为纯合子缺失。图2显示1例肿瘤组织中P16基因半合子缺失。
图1多重PCR扩增结果
2、4、6、8道：肿瘤组织标本；1、3、5、7道：对应的非癌肝组织标本；M：分子量参照物；6、8道：P16基因第2外显子纯合子缺失
fig 1Result of multiplex polymerase chain reaction
Lanes 2,4,6,8 tumor sample; Lanes 1,3,5,7 sample of correspondant non-tumor liver tissue; M: PCR Markers; Lanes 6,8 homozygous deletions of P16 gene exon 2
图2多重PCR扩增结果
t：肿瘤标本；N：相应的非癌肝组织标本；图示肿瘤组织P16基因第2外显子半合子缺失
fig 2Results of multiplex polymerase chain reaction
T:Tumor sample; N:sample of non-tumor liver tissue;Tumor sample showed hemizygous deletion of P16 gene exon 2
2.2P16基因突变分析
对未发现P16基因缺失的22例肿瘤标本作P16基因第2外显子的突变检查。PCR产物经限制性内切酶SmaⅠ切成252 bp与257 bp两个片断后，作SSCP凝胶分析。全部标本中均未发现有异常泳动的单链DNA条带。即未发现有突变存在，见图3。
图3SSCP分析结果
1、3、5道：肿瘤标本；2、4、6道：相应的非肿瘤组织标本；M：分子量参照物(PBR 322/Hae Ⅲ Markers，华美生物工程公司)；SS DNA：单链DNA
Fig 3Results of single strand conformational
polymorphism analysis
Lanes 1,3,5 tumor sample; Lanes 2,4,6 sample of correspondant non-tumor liver tissue; M:PCR Markers; ssDNA: Single strand DNA
2.3P16基因甲基化情况
采用多重PCR法对P16基因5′CpG岛甲基化进行分析。若P16基因第1外显子被甲基化，则不会被SmaⅠ切断，而出现PCR扩增产物，本组肿瘤标本中有6例出现甲基化，占24%(6/25)。而全部非肿瘤标本中则未发现有甲基化存在。图4显示4例肿瘤标本中P16基因出现甲基化(泳道2，6，8，10)。
