国外医学情报2000年第21卷第1期（总第457期）

辽宁卫星生物制品研究所 汪军远（综述） 张玉勤（审校）

摘要 文中介绍了恶性肿瘤的发展与新血管生成的关系和血管生成抑制因子的研究进展，重点是目前最有效的一种抑制内皮细胞增殖的特异性血管生成抑制内皮抑素，这种蛋白分子能抑制原发和转移肿瘤，耐受性好且无毒性，也可用于治疗其他与血管生成相关的疾病。

关键词：血管生成 血管抑素 内皮抑素

在胚胎的正常发育及手术和损伤后的伤口修复中，血管生成起着重要作用，但是它也成为许多病理变化的发病机理，包括恶性肿瘤在内。近年来的基础及临床研究表明新的血管的发育生长与肿瘤的生长和转移、风湿性关节炎、失明等疾病有密切关系。

肿瘤血管化是个复杂过程，它包括基底膜和细胞内基质的水解，血管内皮细胞的增殖、转移和排列，环状血管的形成和新的基底膜形成。新的毛细血管起源于微静脉，在血管生成刺激的微静脉基底膜处产生局限性退变，在高度胶原酶和血浆酶原激活剂分泌处，毛细血管内皮细胞将受到刺激。通过基底膜上的裂隙，内皮细胞开始受到血管生成刺激，形成起始的发芽，继之出现管腔。发芽中段的内皮细胞开始有丝分裂，形成环圈，并相互吻合，这些环圈延伸形成另一些发芽，并缓慢地逐步移动，在毛细血管芽上形成外皮细胞，继而合成新的基底膜。只有抑制血管生成才能使肿瘤生长停止、萎缩，甚至消失。肿瘤血管化主要是肿瘤细胞、血管内皮细胞及其微环境相互作用和影响的结果。这一过程通过促血管生成因子和血管生成抑制因子的相互作用来实现。促血管生成因子是一大类诱导肿瘤血管形成的生长因子和细胞因子的多肽物质。成纤维细胞生长因子（FGF）、血管内皮生长因子（VEGF）及血管渗透性因子（VPF）等都能诱导血管化。另外，还确认了几种负调因子，如血小板因子-4、α-干扰素、血小板反应素（thrombospondin）和血管生成素（angiopoi- etin）。促血管生成因子刺激内皮细胞的转移和增殖，血管生成抑制因子的作用与其相反，血管的生成取决于作用相反的各因子间的平衡。

1.血管生成抑制因子的研究

以美国哈佛医学院Judah Folkman博士为首的研究组25年前开始从事抑制血管生成药物领域的研究，并已将一些有希望的药物推向临床。现已知道一些化合物及蛋白质有抑制血管生长的活性。其中TNP-470是目前认为较好的小分子药物，它活性高，能明显地抑制肿瘤生长。在临床实验中用于治疗多种癌症，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、子宫癌等。哈佛医学院报道了用TNP-470治愈的肺癌病例。但是TNP-470的缺点在于增大给药剂量后，引起神经毒性而导致头晕等。

1994年Michael o'Reilly博士和Judah Folkman博士从Lewis原发肺肿瘤中分离出一种阻碍肿瘤生长的物质。这种物质在患有肿瘤的动物尿液和血液中存在，但含量极少，最终证明它是一种普通的大蛋白—纤维蛋白溶酶原的一个片段，Folkman将其命名为angiostatin（血管抑素）。随后发现在人体中同样存在这种物质。纤维蛋白溶酶原基因有两种用途，完整的纤维蛋白溶酶原对阻止肿瘤生长无任何作用，一种38KDa的裂解片段即angiostatin是最早发现的特异性抑制内皮细胞增殖的血管生成抑制因子。全身应用人angiostatin发现可抑制人和鼠的原发肿瘤，耐受性好且没有毒性。

接着，根据相似的分离原理研究人员从鼠的血管内皮瘤中分离提纯了第二种蛋白片段endostatin（内皮抑素），它对肿瘤的抑制效应比angiostatin更强。将其注射给有巨型肿瘤的鼠，其肿瘤相当于人体内1磅半的肿瘤，在显微镜下可以看到endostatin使肿瘤萎缩。

Angiostatin和endostatin在动物实验中观察到目前最好的抗肿瘤效果。Entremed公司正在研制开发这两种药物。鼠的endostatin已采用基因重组技术用大肠杆菌进行表达获得，动物实验已在美国取得成功，世界新闻报道endostatin已应用于临床。endostatin是胶原蛋白XVⅢ的20KDa的C-末端片段，它能特异性地抑制内皮增殖，对血管化和肿瘤生长有很强的抑制作用。

2. 抗肿瘤作用

血管生成抑制疗法的抗肿瘤作用表现在以下几个方面：

（1）抑制内皮细胞增殖

（2）抑制肿瘤转移

（3）抑制血管生成

（4）抑制原发肿瘤和转移肿瘤生长

2.1抑制内皮细胞增殖

在体外动物实验中endostatin抑制内皮细胞的增殖，但是对Lewis肺癌细胞或其他非内皮细胞无效，其中包括平滑肌、上皮细胞、成纤维细胞和EOMA细胞株。小牛的毛细血管内皮细胞明显地被抑制，抑制的最小剂量为100ng/ml，最大剂量为600ng/ml或更多。即使采用比抑制毛细血管内皮细胞剂量高1个对数级的剂量，也没有观察到对非内皮细胞的明显抑制。

2.2抑制肿瘤转移

实际上大多数癌症患者死于大量的转移二期肿瘤而不是原发肿瘤，有时患者有单一肿瘤，没有任何转移迹象，肿瘤切除后状况很好，但是几个月后，就会有一系列肿瘤转移、生长，最终导致患者死亡。Folkman通过研究发现肿瘤既产生促血管生成因子又产生血管生成抑制因子，抑制因子通过血液循环，抑制肿瘤转移。当肿瘤切除后，不再产生抑制因子，就开始出现肿瘤转移。

用endostatin治疗切除了Lewis肺肿瘤的鼠，每天给这些鼠皮下注射0.3mg/kg endostatin进行系统治疗几乎能完全抑制肺表面的转移位点（每只鼠转移位点数目7±4 n=4），给切除原发Lewis肺肿瘤的对照鼠注射生理盐水，肺肿瘤迅速转移（每只鼠77±7个转移位点，P＜0.001）。在endostatin治疗的任何鼠中没有发现体重减少和毒性现象。

2.3抑制血管生成

新血管的形成是肿瘤转移的必要条件，血管为肿瘤细胞进入循环系统提供了首要途径。对很多肿瘤来说，血管密度可以预测肿瘤可能的转移能力，血管密度高的肿瘤比血管密度低的肿瘤发生转移的可能性大。肿瘤血管化由产生的促血管生成因子调节，其中包括成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子。另外，肿瘤可以激活血管生成抑制因子，如angiostatin和endostatin，它们能调节肿瘤原位点和转移下游位点的血管生成。鸡胚尿囊膜（CAM）测试法能有效地定性、定量测定血管生成抑制因子的抑制能力。每个鸡胚给予0.1～100ug的angiostatin，剂量增加到20ug时产生抑制作用，继续增加至100ug达到饱和，用endostatin进行CAM测试，可观察到在48hr内有最大的抗血管生成效应，且未发现毒性。

2.4抑制原发肿瘤的生长

将Lewis肺肿瘤移植到鼠体内，生长至100～200mm³时用endostatin进行全身性治疗，能有效地抑制原发肿瘤的生长，剂量愈大，效用愈强。与对照鼠相比采用2.5mg/kg的剂量能抑制53%的肿瘤，加大剂量至10mg/kg能抑制97%的肿瘤。每天注射20mg/kg剂量几乎能完全抑制原发肿瘤（＞99%抑制，P＜0.001）。移植了另外几种恶性瘤，包括B16F10恶性瘤，T241纤维肉瘤和EOMA血管内皮瘤的小鼠，用endostatin治疗后都可观察到肿瘤迅速缩小。

3. 抗药性及毒性

肿瘤产生抗药性是目前所用的放射、免疫以及化学疗法面临的严重问题。抗药性的出现部分原因是遗传不稳定性，异性生殖和肿瘤细胞的高突变率。相比较而言，内皮细胞遗传稳定，同源突变率低，抗血管生成疗法直接针对肿瘤内皮细胞，内皮细胞对这种疗法的抗药性很小甚至没有抗药性。Lewis肺癌是最难用抗癌药物治疗的癌症之一，能很快对细胞毒化学疗法产生抗药性，选择对其最有效的环磷酰胺单独治疗，几乎没有动物被治愈，患有恶性肿瘤的鼠每隔一天分三次接受最大耐受剂量150mg/kg。发现在100～500mm³之间的Lewis肺肿瘤稳定了大约13天，然后开始生长。在另一组实验中，用endostatin治疗有Lewis肺癌的鼠，进行了6个疗程共185天。治疗鼠没有产生抗药性。第6个疗程结束时，endostatin对肿瘤的抑制和第一个疗程中的基本相同。到目前为止，还没有发现任何有关endostatin的毒性和产生抗药性的报道。

4. 血管生成抑制基因疗法

重复注射重组内皮抑素能有效阻止肿瘤的血管化，并抑制肿瘤生长和转移。另外，也没有发现肿瘤对抗血管生成疗法的重复循环治疗产生获得性抗药性，但是，连续注射重组蛋白价格较贵，不方便，而且重组蛋白注射后浓度虽较高但迅速代谢。反复注射也可能带来病毒感染，影响免疫系统。Paul blezinger等人将编码分泌型内皮抑素的系统表达基因注射到小鼠的骨骼肌中，能够持续两周表达和分泌内皮抑素至血液循环系统。表达量和持续时间足以抑制原发肿瘤和转移病灶。另外，表达的内皮抑素降低肿瘤细胞凋亡。这表明利用肌肉传递的抗血管生成基因疗法比注射重组蛋白更方便。但是，在动物实验中没有发现此前所看到的肿瘤萎缩，这可能是由于两种治疗法的用药剂量引起的内皮抑素蛋白在循环中的生物利用度和药动学不同。

5. 适应症

endostatin是一种很强的血管生成抑制因子，可用于治疗Lewis肺癌，T241纤维肉瘤或B16F10黑素瘤，也可以用于治疗其他与血管相关的疾病，如：依赖血管生成的风湿性关节炎，牛皮癣，眼部血管生成疾病，Osler-Webber综合征，心肌的血管生