及白细胞介素-1β-转化酶表达的影响

中国胃肠外科杂志1999年第2卷第4期

李荧顾晋马朝来彭亦凡于永祥

【摘要】目的探讨术前区域动脉灌注化疗对结直肠癌细胞凋亡及白细胞介素-1β-转化酶(ICE)表达的影响。方法对30例术前区域动脉灌注化疗及20例术前未行任何化疗的结直肠癌患者的病理标本，用DNA原位末端标记检测肿瘤细胞凋亡并应用LASB法进行ICE检测。结果术前动脉化疗组与未化疗组肿瘤细胞凋亡数分别为(61.22±3.99)和(40.11±3.96)个/高倍视野，两者间有显著性差异(P＜0.001)。术前动脉化疗组ICE阳性表达亦明显高于非化疗组(P＜0.05)。术前化疗组内肿瘤细胞凋亡与ICE表达相关分析表明两者间存在正相关(r=0.591,P＜0.05)。结论术前区域动脉灌注化疗对结直肠癌细胞有明显促凋亡作用。

【关键词】结直肠癌动脉化疗凋亡白细胞介素-1β-转化酶

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，治疗效果尚不满意。术前区域动脉灌注化疗(preoperative regional intraarteral chemotherapy, PRAC)配合手术是近年来新开展的治疗方法之一。本研究旨在探讨PRAC对结直肠肿瘤细胞凋亡及其相关基因白细胞介素-1β-转化酶基因(ICE)的影响。

材料和方法

一. 一般资料

我院自1997年1月至1998年10月间接受PRAC的结直肠癌患者30例，其中男16例，女14例；60岁以下11例，60岁以上(包括60岁)19例。Dukes分期，A期0例，B期19例，C期11例，D期0例；高、中、低分化癌分别为5例、23例、2例。同期未行PRAC者20例作为对照组，其中男9例，女11例；60岁以下6例，60岁以上(包括60岁)14例；A期0例，B期7例，C期13例，D期0例；高、中、低分化癌分别为3例、15例、2例。

二. 治疗方法

1. PRAC组术前采用Seldinger技术，经股动脉插管至肠系膜上(下)动脉及直肠上动脉。按癌肿所在部位选择性插管，回盲部癌选回结肠动脉，升结肠癌选右结肠动脉，横结肠癌选结肠中动脉，降结肠癌选左结肠动脉，乙状结肠癌选乙状结肠动脉，直肠癌选直肠上动脉，直肠下段及肛管癌选双侧髂内动脉及直肠上动脉，若不易找到以上血管，则右半结肠选肠系膜上动脉，左半结肠选肠系膜下动脉。造影剂选优维显370(Ultravist 370)50 mL，数字减影血管造影机为荷兰PHILIPS公司PHILIPS INTEGRIS V3000数字减影机，行选择性动脉造影。所有病例造影效果满意^［1］，影像清晰，根据肿瘤紊乱的血管团显示肿瘤供血动脉后注入化疗药物5-FU 750 mg/m²，丝裂霉素(MMC)20 mg、顺铂80 mg，化疗后10天行结直肠癌根治术。

2. 对照组术前不经动脉化疗而直接行结直肠癌根治术。

三. 试验方法

DNA原位末端标记检测凋亡试剂盒购于Boehringer Mannheim公司，NBT/BCIP显色剂购于DAKO公司，ICE试剂购于Santa Cruz公司，均保存于-20^°C冰箱中。检测凋亡采用原位末端标记技术(TUNEL)。ICE检测采用LASB法。

凋亡细胞判断标准：肿瘤细胞胞核染色为蓝色者为阳性细胞。随机选取10个高倍视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，计算细胞凋亡数。

ICE检测：肿瘤细胞胞浆染色为黄色或黄褐色者为阳性细胞，计数采用半定量方法，分别按切片中细胞染色有无、深浅、切片中显色细胞比例评分，按积分高低分为“-”(0分)、“+”(1～4分)、“”(大于4分)，将“-”定为阴性，“+”、“”定为阳性。

四. 统计方法

试验数据统计分别采用SPSS统计软件(Version, 7.5,美国)，t检验，χ²相关分析。

结果

一. PRAC组与对照组细胞凋亡比较

PRAC组30例患者中肿瘤细胞凋亡数量为(61.22±3.99)个/高倍视野，而对照组为(40.11±3.96)个/高倍视野，t检验统计分析显示术前动脉化疗组每高倍视野肿瘤细胞凋亡数明显高于对照组，P＜0.001(图1，2)。该结果提示PRAC可能促进结直肠癌细胞的凋亡。

图1术前动脉灌注化疗后结直肠癌组织细胞凋亡显著

(箭头所示为凋亡细胞，细胞核蓝染，200×)

图2术前未经动脉化疗结直肠癌组织细胞凋亡不明显

二. PRAC组与对照组ICE表达的比较

PRAC组30例患者均呈阳性表达(100%)，肿瘤细胞胞浆染色呈棕黄色或黄色，对照组20例中12例呈阴性表达(60%)，8例呈弱阳性表达(40%)，肿瘤细胞胞浆染色呈浅黄色或未染色，经χ²检验P＜0.05，两组间存在显著差异。表明PRAC可能对肿瘤细胞ICE表达产生影响，促进其表达。

三. PRAC组患者肿瘤细胞凋亡与肿瘤分期及病理分化程度的关系

PRAC组30例患者中B期19例，C期11例，肿瘤细胞凋亡的数量B期及C期分别为(61.80±3.91)和(60.22±4.10)个/高倍视野，无显著性差异。在病理分化程度高、中、低3组中肿瘤细胞凋亡的数量分别为57.88、62.04及59.80个/高倍视野，亦无显著性差异。该结果提示PRAC组患者肿瘤细胞的凋亡与肿瘤的分期及病理分化程度无关。

四. PRAC组ICE表达与肿瘤细胞凋亡的关系

经相关分析表明，r=0.591,P＜0.05，两者呈正相关。

讨论

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，治疗效果不满意。近年来随着区域化疗的逐渐开展，为实体肿瘤的治疗提供了新的途径。对胃肠道肿瘤动脉化疗研究发现，动脉化疗可以使肿瘤局部、胃肠壁内、淋巴内和门静脉内药物浓度较体循环高，从而提高了抗肿瘤效应，减少了对体循环的毒副作用。结直肠癌术前动脉灌注化疗作为区域化疗的方式之一，在临床工作中日益受到重视。Maurer等^［2］对消化道肿瘤区域动脉灌注化疗的研究结果表明，区域灌注化疗肿瘤边缘化疗药物浓度是全身化疗的9～68倍，使癌细胞在化疗药物中充分暴露，提高反应率，不良反应少。

细胞凋亡(apoptosis)即程序性细胞死亡，是有核细胞在一定条件下，通过启动其自身内部机制，主要是通过内源性DNA内切酶的激活发生细胞自然死亡的过程。许多疾病的发生与细胞凋亡失控有关，一方面能成为神经退变疾病和免疫缺陷的疾病，另一方面也可能成为肿瘤的病因^［3］。

体外研究表明通过许多化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤细胞生长、促进其死亡^［3］。区域动脉灌注化疗有利于化疗药物直接进入原发灶血管床，发挥较强的抗癌作用。同时，化疗药物经血液循环作用于可能存在的转移病灶，从而减少术后的肿瘤复发和转移。我们选用的5-FU、MMC及顺铂是作用于细胞周期的药物，其中5-FU为S期特异性药物，作用于DNA合成期，抑制DNA合成，MMC同样作用于S期，抑制DNA合成，顺铂主要阻断G₂期，阻断细胞的有丝分裂。本组研究表明，术前行动脉区域灌注化疗组患者的肿瘤细胞凋亡数目较对照组明显升高，两者间存在显著性差异。可能的机制是上述3种化疗药物或许在一定的程度上破坏肿瘤细胞的增殖，而促进了肿瘤细胞的凋亡。

有许多因素可以诱发细胞凋亡，在凋亡信号传导中，ICE样蛋白酶(caspase)的作用日益受到重视，许多调控细胞凋亡的因素可通过ICE样蛋白酶起作用。遗传及生物化学研究证明^［4］，诱发细胞凋亡的中心成分为死亡基因的ICE，ICE基因在人定位于染色体11q23，编码由404个氨基酸残基组成的45 KD蛋白，该蛋白以无活性的酶原形式存在，裂解后产生2个亚单位参与细胞凋亡，ICE可参与其他多种因素诱导的细胞凋亡过程，如某些化疗药物(如顺铂)诱导的凋亡。ICE诱导凋亡的机制还不十分清楚，但它在凋亡中的中心作用已得到肯定。本组研究中发现，术前区域动脉灌注化疗组ICE的表达明显高于对照组，可能说明术前动脉化疗可以诱导肿瘤细胞ICE的表达，促使肿瘤细胞发生凋亡。通过对PRAC组肿瘤细胞凋亡及ICE的表达进行相关性比较发现，二者间存在正相关。提示化疗药物可能通过刺激肿瘤细胞ICE的表达进而诱发肿瘤细胞凋亡的发生，这为进一步研究动脉灌注化疗诱导凋亡的研究提供了依据。

本组研究表明，术前区域动脉灌注化疗对结直肠癌细胞可能存在明显的促凋亡作用，为结直肠癌患者的综合治疗提供了一些有意义的资料。

本课题为卫生部科研基金资助项目

作者单位：北京医科大学人民医院外科

参考文献

1顾晋，马朝来，朱健钢，等.术前选择性动脉造影及灌注化疗在结直肠癌诊断和治疗中的价值.中华普通外科杂志 1999；14：119-121.

2Maurer CA, Borner M, Buchler MW, et a