国外医学消化系疾病分册1999年第19卷第1期

第二军医大学附属长征医院（200003）

贾淑云* 马述春综述 张忠兵审校

摘要 本文综述了目前可用于胰腺癌临床诊断的相关基因，认为K-ras基因及端粒酶基因最有诊断价值。K-ras基因在胰腺癌中的突变率为75%～100%，检测端粒酶活性诊断胰腺癌有100%的敏感性及特异性。尽管p53基因在胰腺癌中有一定的突变率，但单独用于临床诊断的意义不大。DPC4基因是新近发现的一种抑癌基因，在胰腺癌中的突变率约50%，有望进一步用于临床。临床上获取用于检测的标本，主要通过经皮细针穿刺活检、ERCP下刷检及收集胰液、插管收集十二指肠液、收集粪便或血液中的脱落细胞。

关键词：胰腺癌 基因检测 诊断

胰腺癌的发病率近几年明显增加，死亡人数也在上升。胰腺位于腹腔后壁，恶性病变发生较隐蔽，一旦临床发现，多数已失去了手术机会，因此迫切需要诊断早期胰腺癌的有效方法。目前临床上常用的CT及超声波难以诊断小于2cm的胰腺肿瘤，而CEA和CA19-9等传统的血清标志物往往在肿瘤发生转移后才升高^[1]。分子遗传学的研究为胰腺癌早期诊断开辟了另一途径，本文仅对目前胰腺癌的基因诊断在临床上的应用现状作一综述。

肿瘤的发生是多阶段的复杂过程，涉及到多种癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活，胰腺癌也是如此。临床上可通过经皮细针穿刺活检或ERCP刷检等方式获取胰腺组织和细胞，收集胰液、十二指肠液、血液和粪便，检测其中癌相关基因。目前各国学者讨论较集中的胰腺癌相关基因是ras基因、p53基因、端粒酶基因及近两年发现的DPC4基因。

1 ras基因

目前认为ras基因是最常见的人肿瘤突变癌基因，在肺癌、结直肠癌及膀胱癌等肿瘤中，30%～66%可发生ras基因突变，而突变率在胰腺癌中最高，可达75%～100%^[1]。

1.1 ras基因结构、功能和意义

ras基因家族由K-ras、H-ras和N-ras组成，编码蛋白质由188～189个氨基酸构成，分子量为21kD。该蛋白位于细胞膜的内表面，类似于已知的G蛋白，与GTP和GDP结合，具有GTP酶活性，它可能作为分子“开关”，以膜结合受体形式传递信号到细胞靶位。ras基因的激活能导致肿瘤发生，激活有多种形式，可以是表达增加，或是基因突变，或是内在的GTP酶活性下降，也可以是与GTP及GDP结合的亲和力降低，基因突变往往发生在12、13和61密码子，以12密码子最常见。

1988年，Almogarara等首先报道，采用RNA酶A错配切割法，检测了22例胰腺癌标本，结果K-ras基因的突变率高达95%，突变点均位于12密码子。此后Motojima和Yashiro对手术切除的胰腺癌标本进行K-ras基因分析，分别有88.6%和78.5%的突变发生率。Hruban汇总450例胰腺癌，平均K-ras突变率为78%。他指出：①由于K-ras基因的点突变基本上局限在12密码子，故应用有限数量的探针就可测出这些突变。②胰腺癌有很高的K-ras突变率，K-ras可作为判断胰腺癌存在的敏感标记物。③K-ras突变存在于胰腺原位癌，因此可用于早期诊断^[2]。

1.2 k-ras临床检测

1.2.1 经皮细针穿刺活检组织检测K-ras基因

tada等^[3]在B超引导下细针穿刺获取胰腺细胞，采用PCR扩增测序法检测DNA，结果12例胰腺癌病人皆发现有K-ras基因12密码子突变，而6例慢性胰腺炎病人均阴性。王志永等用PCR-RFLP技术检测了27例细针穿刺活检组织，经病理和（或）手术确诊，结果15例胰腺癌中14例（93%）有K-ras突变，1例假阴性，12例非胰腺癌病人均阴性。临床上对疑有胰腺癌者行经皮细针穿刺，检测K-ras基因，特别是PCR-RFLP方法的检测物为DNA片段，需微量标本即可，操作简便、快速，故可用于临床上胰腺癌的诊断。

1.2.2 收集胰液及十二指肠液检测K-ras基因

k-ras基因突变仅存在于胰导管源性肿瘤，肿瘤细胞脱落后可经胰液排出，故收集胰液可检测到K-ras突变。1993年Tada等^[4]于注射促胰素后在ERCP下收集胰液，结果6例胰腺癌全部有K-ras突变，1例胆石症及2例慢性胰腺炎均阴性。后来，Berthelemy^[5]也测到83%的K-ras突变率。Iguchi^[6]则用Dreiling管收集十二指肠液，采用单链构象多态性分析法（PCR-SSCP）测出K-ras突变率为63%，用此方法收集胰液简单易行，PCR-SSCP技术简单、较敏感，阳性率又明显高于传统的细胞学检查，较适用于胰腺癌的早期诊断。

1.2.3粪便中检测脱落细胞K-ras基因

也可依靠粪便中出现突变K-ras来诊断胰腺癌。粪便中突变K-ras主要源于排入肠腔的胰液中所含有的肿瘤细胞。Caldas等^[7]采用斑点杂交技术检测11例胰腺癌病人的粪便，有6例出现K-ras点突变，与直接收集胰液相比，粪便中突变K-ras阳性率相对偏低，但由于简单易行，可望用于胰腺癌的普查。

1.2.4血液中检测K-ras基因

当胰腺癌发生血行转移时，在外周血中可测到K-ras突变。有报道用PCR技术检测6例胰腺癌的外周血，其中3例有转移癌细胞者出现了K-ras基因突变^[4]。而2例胰岛素瘤病人的外周血中无K-ras突变^[4]。故认为此法有助于检测胰腺癌有无血行转移。

1.2.5 eRCP刷检物检测K-ras

1995年，Apple等^[8]检测了60份ERCP下刷检物进行细胞学检查，经临床随访证实，46例胰腺癌中有44例（95.7%）K-ras基因12位点突变，而12例胰腺良性病变及2例胰岛细胞瘤均阴性，认为此法可弥补形态学上的诊断困难，尤其是标本量偏少时尤为适用。

有研究者^[9]在ERCP下对胰管造影见有主胰管狭窄的45例患者进行刷检，检测刷检物K-ras突变并与传统的细胞学涂片进行比较，结果发现胰腺癌有83%（20/24）的K-ras突变率，16例慢性胰腺炎及5例胰管内粘蛋白高分泌瘤均阴性。尤其重要的是，其中6例肿瘤直径≤2cm的胰腺癌有K-ras突变，而细胞学检查的阳性率只有54%。可以看出，ERCP下刷检物K-ras突变检出率明显高于传统细胞学检查，并且K-ras突变发生在胰腺癌早期，更有利于临床早期诊断。

也有少数良性胰腺疾病发生K-ras基因突变的报道，Tada等^[10]观察到，79份胰管粘液细胞增生灶有19份（24%）出现K-ras突变，而16例正常胰管无一例出现K-ras突变，30份胰腺癌均阳性；Yanagisawa等^[11]发现，由慢性胰腺炎引起的胰管粘液细胞增生K-ras第12密码子突变率62.5%（10/16）。他们推测这些良性病灶可能属于癌前突变，是否如此，尚有待于进一步研究。

大多数报道认为，K-ras基因突变与胰腺癌预后、分期无关，但可能与转移有关。Motojima等^[12]检测了57例病人胰腺癌组织的K-ras突变，发现Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的肿瘤K-ras突变率分别为100%（1/1）、100%（5/5）、85%（17/20）、85%（23/27）；癌灶直径≤2cm、2.1～4.0cm、4.1～6.0cm、≥6.1cm的病例K-ras突变率分别为100%（1/1）、89%（17/19）、90%（19/21）和75%（3/4）；肿瘤无淋巴结转移、近处转移和远处转移K-ras突变率分别为87%（13/15）、85%（17/20）和100%（10/10）。

2 p53基因

p53基因是一类重要的肿瘤抑制基因，与多种肿瘤的发生有关。有人总结了2567例肿瘤，37%有p53基因突变，其中胰腺癌突变发生率为44%。

2.1 p53基因结构、功能和意义

1979年，Lave等人在转化细胞的提取物中首次发现p53基因，以后证实其位于17号染色体短臂，全长约20kb，由11个外显子及10个内含子组成，编码蛋白分子量为53kD。p53是一个重要的细胞增殖周期调节因子，当p53基因突变和功能丧失时，p53介导的细胞周期调节失控，DNA合成程序紊乱，发生遗传不稳定性及多倍性，也可能使p53介导的凋亡丧失，导致肿瘤发生。

2.2临床检测

检测方法主要有：①DNA测序法；②PCR-SSCP法，此法的敏感性及特异性均在90%左右；③免疫组化法，此法的敏感性为75%，阳性预测值为63%。由于p53基因存在于人类多种肿瘤中，而且p53基因在5、6、7、8及其他外显子均可能发生突变，临床上用分子生物学技术检测这些突变既耗时又耗力，故大多数人主张用免疫组化法检测p53基因产物——p53蛋白。正常细胞的p53蛋白半衰期极短，表达水平低而检测不到，当p53基因突变时，其蛋白产物在核内堆积，p53呈高表达，即阳性发现。Barton等检测了22例胰腺癌标本，有13例（60%）p53蛋白阳性，Digiuseppe等检出40%的胰腺癌组织有p53蛋白的过度表达，因此认为，p53基因的改变在胰腺癌发生中有重要作用。

p53基因突变存在于多种肿瘤中，且在胰腺癌中的突变率远低于K-ras，某些良性胰腺病也可出现阳性，故作为基因标志物单独用于胰腺癌的诊断意义不大。Maacke等^[13]报道，15例胰腺癌及27例胰腺炎病人的胰液中，p53蛋白阳性率分别为67%及59%，两者相差不显著，认为在慢性炎症过程中p53过度表达可能由于DNA损害所致。正常及突变的p53蛋白释放入血后，刺激B淋巴细胞产生抗p53蛋白的自身抗体。有人探讨了血中p53蛋白的自身抗体测定，结果发现，胰腺癌中阳性率为18.2%，急性胰腺炎为5.3%，慢性胰腺炎中为12.1%，三者之间<