《生物工程进展》1999年第19卷第4期

杨蓉¹谢文章¹张亮¹朱小山¹ 王国青¹董赫¹

李志明¹陈恳¹陈德朴¹ 程京^1,2

（清华大学生命科学工程研究院，1.生物芯片研究与开发中心，2.生物膜与膜生物国家重点实验室，北京，100084）

摘要生物芯片是便携式生物化学分析器的核心技术。通过对微加工获得的微米结构作生物化学处理能使成千上万个与生命相关的信息集成在一块厘米见方的芯片上。采用生物芯片可进行生命科学和医学中所涉及的各种生物化学反应，从而达到对基因、抗原和活体细胞等进行测试分析的目的。生物芯片发展的最终目标是将从样品制备、化学反应到检测的整个生化分析过程集成化以获得所谓的微型全分析系统（ micro total analytical system）或称缩微芯片实验室（ laboratory on a chip）。生物芯片技术的出现将会给生命科学、医学、化学、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品和环境卫生监督等领域带来一场革命。本文阐述了生物芯片技术在加工制备、功能和应用方面的近期研究进展。

关键词：生物芯片，缩微芯片实验室，疾病诊断，基因表达

人类基因组计划的目标是在2005年完成对30亿个人体基因组 dNA碱基的序列测定，现在通过使用更高级的毛细管阵列测序仪和商业操作，使该计划有望提前完成。因此，人们现已开始利用人类基因组计划中所发现的已知基因对其功能进行研究，亦即把已知基因的序列与功能联系在一起的功能基因组学研究。另外，与疾病相关的研究已从研究疾病的起因向探索发病机理方面转移，并从疾病诊断向疾病易感性研究转移。由于所有上述这些研究都与 dNA结构、病理和生理等因素密切相关，因此许多国家现已开始考虑在后基因组时期，研究人员是否能用有效的硬体技术来对如此庞大的 dNA信息以及蛋白质信息加以利用。为此，先后已有多种解决方案问世，如 dNA的质谱分析法^[1]、荧光单分子分析法^[2]、阵列式毛细管电泳^[3]、杂交分析^[4]等。但到目前为止，在对 dNA和蛋白质进行分析的各种技术中，发展最快和应用前景最好看的技术当数以生物芯片技术为基础的亲和结合分析、毛细管电泳分析法^[5]和质谱分析法。此外，在此基础上，通过与采用生物芯片技术和样品制备方法（芯片细胞分离技术^[6]和生化反应方法（如芯片免疫分析^[7]和芯片核酸扩增^[8]）相结合，许多研究机构和工业界都已开始构建所谓的缩微芯片实验室。建立缩微芯片实验室的最终目的是将生命科学研究中的许多不连续的分析过程，如样品制备，化学反应和分离检测等，通过采用象集成电路制作过程中的半导体光刻加工那样的缩微技术，将其移植到芯片中并使其连续化和微型化。这些当年将数间房屋大小的分离元件计算机缩微成现在只有书本大小的笔记本式计算机有异曲同工之效。用这些生物芯片所制作的具有不同用途的生化分析仪具有下述一些主要优点，即分析全过程自动化、生产成本低、防污染（芯片系一次性使用）、分析速度可获得成千上万倍的提高、同时，所需样品及化学药品的量可获得成百上千倍的减少、极高的多样品处理能力、仪器体积小、重量轻、便于携带。这类仪器的出现将会给生命科学、医学、化学、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品和环境卫生监督等领域带来一场革命。因此，它已广为各国学术界和工业界所瞩目^[9]。

1 生物芯片的微加工制备

生物芯片的加工借用的是微电子工业和其他加工工业中比较成熟的一些微细加工（ microfabrication）工艺（如：光学掩模光刻技术、反应离子刻蚀、微注入模塑和聚合膜浇注法），在玻璃、塑料、硅片等基底材料上加工出用于生物样品分离、反应的微米尺寸的微结构，如过滤器、反应室、微泵、微阀门等微结构。然后在微结构上施加必要的表面化学处理，再在微结构上进行所需的生物化学反应和分析。

生物芯片中目前发展最快的要算亲和结合芯片（包括 dNA和蛋白质微阵列芯片）。它的加工除了用到一些微加工工艺以外，还需要使用机器人技术。现在有四种比较典型的亲和结合芯片加工方法。一种是 affymetrix公司开发出的光学光刻法与光化学合成法相结合的光引导原位合成法^[10]。第二种方法是 incyte pharmaceutical公司所采用的化学喷射法，它的原理是将事先合成好的寡核苷酸探针喷射到芯片上指定的位置来制作 dNA芯片的。第三种是斯坦福大学所使用的接触式点涂法。该方法的实现是通过使用高速精密机械手所带的移液头与玻璃芯片表面接触而将探针定位点滴到芯片上的^[11]。第四种方法是通过使用四支分别装有 a、 t、 g、 c核苷的压电喷头在芯片上作原位 dNA探针合成的^[12]。

2生物芯片举例

生物芯片是缩小了的生物化学分析器，通过芯片上微加工获得的微米结构和生物化学处理结合，便可将成千上万个与生命相关的信息集成在一块厘米见方的芯片上。采用芯片可进行生命科学和医学中所涉及的各种生物化学反应，以达到对基因、抗原和活体细胞等进行测试分析的目的。通过分析可得到大量具有生物学、医学意义的信息。生物化学反应和分析过程通常包括三个步骤：1，样品制备；2，生物化学反应；3，检测和数据分析处理。将其中一个步骤或几个步骤微型化集成到一块芯片上就能获得具有特殊功能的生物芯片，例如用于样品制备的细胞过滤器芯片和介电电泳芯片、用于基因突变检测和基因表达的 dNA微阵列芯片和用于药物筛选的高通量微米反应池芯片等。现在，世界各国的科学家们正致力于将生化分析的全过程通过不同芯片的使用最后达到全部功能的集成，以实现所谓的微型全分析系统或缩微芯片实验室。使用缩微芯片实验室，人们可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。

2.1 样品制备芯片

针对 dNA分析，其制备过程通常要经过细胞分离、破胞、脱蛋白等多方面的工作，最后得到纯度足够高的待检 dNA。目前在细胞分离方法上较突出的有过滤分离（根据生物颗粒的尺寸差异进行分离）和介电电泳分离（利用在芯片上所施加的高频非均匀电场使不同的细胞内诱导出偶电极，导致细胞受不同的介电力作用，而从样品中分离出来）等；芯片中的破胞方法有芯片升温破胞、变压脉冲破胞，以及化学破胞等。在捕获 dNA方面， cepheid公司应用湿法蚀刻和反应离子蚀刻/等离子蚀刻等工艺在硅片上加工出含有5000个高200微米直径20微米的具有细柱式结构的 dNA萃取芯片，专门用于 dNA的萃取^[13]。

2.2 生物化学反应芯片

由于目前所用检测仪器的灵敏度还不够高，因此从样品中提取的 dNA在标记和应用前仍需用 pCR这样的扩增复制技术复制几十万乃至上百万个相同的 dNA片段。

目前，在芯片中进行核酸扩增反应获得成功的有宾夕法尼亚大学研究小组^[8，14]，美国劳伦斯-利物摩国家实验室^[15]和 perkin-Elmer公司^[16]。宾夕法尼亚大学研究小组所做的扩增反应都是在硅-玻璃芯片中进行的，芯片的外部加热和冷却采用的是计算机控制的帕尔帖电-热器。在对芯片表面进行惰性处理后，亦即在硅片表面生长一层2000埃的氧化硅之后，他们成功地在硅-玻璃芯片中完成了一系列不同的核酸扩增反应，例如 rT-PCR、 lCR、多重 pCR和 dOP-PCR。由劳伦斯-利物摩国家实验室加工的硅芯片所采用的加热方式是芯片内置的薄膜多晶硅加热套，其升降温的速度很快。 perkin-Elmer公司的 pCR反应则是在塑料芯片上完成的。伦敦帝国理工大学的研究者研制了一种样品可在不同温度的恒温区间内连续流动的 pCR芯片^[17]。上述所有工作都是用事先提纯了的 dNA或 rNA作为扩增反应的底物来完成的。为了将样品制备和扩增反应集成为一体，宾夕法尼亚大学研究小组最近成功地在坝式微过滤芯片中直接对分离所得的人白细胞通过升温方式胞解后所释放的 dNA进行了扩增，这是世界上首例将样品制备和扩增反应集成为一体的研究成果^[14]。

2.3 检测芯片

2.3.1毛细管电泳芯片

芯片毛细管电泳是1983年由杜邦公司的 pace开发出来的^[18]。随后，瑞士的 ciba-Geigy公司和加拿大的 alberta大学合作利用玻璃芯片毛细管电泳完成了对寡核苷酸的分离^[19]。首次用芯片毛阵列电泳检测 dNA突变和对 dNA进行测序的是由加利福尼亚大学伯格利分校 mathies领导的研究小组完成的^[20,21]。通过在芯片上加上高压直流电，他们在近两分钟的时间内便完成了从118bp到1353bp的许多 dNA片段的快速分离。此外， mathies的小组与劳伦斯-利物摩国家实验室 nothrup的研究小组合作，报道了首例将核酸扩增反应与芯片毛细管电泳集成为一体所作的多重 pCR检测工作^[22]。宾夕法尼亚大学 wilding的小组与 ramsey的小组一道用芯片毛细管电泳对芯片中扩增得到的用于杜鑫-贝克肌萎缩诊断的多条 dNA片段进行分离也获得了成功^[14]。其他用芯片毛细管电泳检测突变的外国公司和学术机构有 perkin-Elmer公司、 caliper technologies公司、 aclara biosciences公司和麻省理工等。

2.3.2 DNA突变检测芯片

dNA