《生物工程进展》1999年第19卷第4期

沈珝琲

医学分子生物学国家重点实验室 基础医学研究所

中国医学科学院 中国协和医科大学，北京100005

关键词：核小体 染色质 动态调整 基因转录

核小体是真核细胞染色质的基本单位。真核基因组DNA在细胞核中储存在染色质结构中。核小体的核心结构是由146个碱基对的DNA盘绕四对核心组蛋白的八聚体外面近两周所构成。核小体核心组蛋白H3/H4两对异源二聚体是核小体亚颗粒的核心，它能稳定地与DNA结合。H2A/H2B二聚体是核小体核心中较不稳定的成分。核小体组装是一个干扰DNA复制、基因表达和细胞周期进展的过程，因此在细胞生命过程中极为重要。在核小体组装时，需要将四对核心组蛋白有序地与DNA结合，重新组成新的、有序的核小体。首先（H3/H4）2与将形成核小体核心外的DNA中段约120碱基对相结合，随后两对H2A/H2B异源二聚体分别在结合了（H3/H4）2的DNA上下游结合，形成完整的核小体，并表现出排列周期有序的“串珠状”核小体结构。确定DNA序列与核小体的相对位置可以用核小体相位（Phased positioning）来表示，其两种方式分别为⑴核小体旋转定位（rotational positioning）：DNA相对于核心组蛋白八聚体表面的方向性，⑵核小体翻译定位（translational positioning）：核小体在特定基因序列上占据的位置。核小体在特定的DNA上定位是决定基因在细胞内能否被活化和转录的关键^[1,2]。

真核细胞的基因及其转录活化需要的顺式作用元件在染色质中的状态对转录效率也至关重要。尽管核小体的基本结构相同，但基因如果处在30nm直径以上的高级结构甚至异染色质中，该基因就不可能转录。除此而外，如果基因和它的重要转录元件如启动子、增强子等被特定的染色质结构间隔开，一般也不能转录。90年代中期以来，陆续在果蝇和哺乳动物基因组中发现了多种起间隔作用的DNA元件和DNA/蛋白质复合体，如隔离子（insulator）、染色体特化结构（specified chromosome structure, SCS）、边界元件（boundary element）以及核骨架结合区（scaffold associated region, SAR）等。这些元件和它们相应结合蛋白所形成的复合体，使真核基因组中的特定基因实际上处在多种活化程度不同的染色质区域内，它们的转录活性也因此各不相同^[1,3]。此外，β-珠蛋白基因簇远端上游的座位控制区（locus control region, LCR）对β-珠蛋白基因簇的特异而有序表达具有重要的调控作用，在转基因动物中LCR的作用很可能参与调节染色质活性结构^[4]。由于上述调控现象的存在，使染色质不同区域出现不同的转录活性，显示出染色质的位置效应的异质性（position effect variegation）。由此可见真核基因的转录不仅需要我们已经熟知的顺式作用元件和反式作用因子的相互作用，还会受到染色质效应的影响。这种调控机理不同于基因在体外以裸露DNA为模板的转录，而是转录前的染色质结构调整（chromatin remodeling）^[5-8]，它也是基因外调控（epi-genetic regulation）的一种重要形式^[1]。

1核小体结构的动态调整

在体内核小体的组装是一个动态过程，核小体有序的周期性结构可因特异转录因子的加入或去除而改变，出现动态调整过程[1]。图1显示染色质结构调整导致基因起始转录的过程，可以用图中的四种状态说明：⑴“串珠状” 核小体甚至更高级结构中的基因处于非活化的基态；⑵当蛋白质因子通过其DNA结合结构域结合到染色质上，局部的染色质转变为去阻遏状态，这一过程不需要ATP和转录因子的反式活化结构域的参与；⑶蛋白因子结合染色质后，依赖于ATP的存在介导了染色质结构的调整，使染色质成为活化状态；⑷结合于染色质的蛋白反式激活结构域参与募集启动子结合蛋白和转录起始前复合体，基因开始转录。由此可见，染色质结合蛋白中的DNA结合结构域是染色质结构动态调整的关键，而其中的反式活化结构域主导基因的转录^[5,9]。

图1核小体结构的动态调整与基因转录活化过程示意图

由于多亚基RNA聚合酶II的直径和相对分子质量均已大于核小体核心结构，体内基因转录时，有聚合酶参与的转录起始复合体必须沿染色质模板向下游滑动并合成RNA，此时染色质结构调整显示出极其重要的影响。1998年首次从人体细胞中分离出一种新的“调整和扩距因子（Remodeling and Spacing Factor, RSF）”^[10]其作用是使核小体间隔扩展，协助特异转录因子结合到其元件区域内，诱导局部核小体结构的重新调整。RSF可能在图1的3-4阶段中，参与调整核小体间的间距，并保证转录前起始复合体的形成；此外，另一个新分离的人类“促染色质转录（Facilitates chromatin transcription, FACT）因子”^[11]在RSF调整染色质结构的基础上，FACT参与协助RNA聚合酶II和转录复合体在RNA链延伸中克服核小体的阻遏作用。

2核心组蛋白的可逆乙酰化与基因转录

在多细胞生物体内约有不超过15%的染色质处于动态的乙酰化调整过程中，染色质的转录活性与组蛋白高度乙酰化状态相伴随^[12]。组蛋白去乙酰化会导致形成阻遏性染色质复合物以至全染色体灭活。1964年Allfrey等人^[13]就报道了组蛋白的乙酰化促进RNA的合成。直到30多年后才克隆了参与组蛋白可逆乙酰化的两大类酶，即组蛋白乙酰基转移酶（Histone Acetyltransferase, HAT）和组蛋白去乙酰基酶（Histone Deacetylase, HDAC）它们调节核小体的结构及其相关基因的转录活性。核小体核心（主要是H3/H4）组蛋白碱性N端的多个赖氨酸残基是可逆乙酰化参与调节基因转录的靶位点^[12,14]。

组蛋白乙酰基转移酶对基因转录的影响可能有下列几个方面：1.高等生物体内最早发现的HAT包括CBP/p300、TAFII250、P/CAF等能直接酶促核心组蛋白的乙酰化，导致染色质的伸展甚至核小体局部结构的暂时缺失，为RNA聚合酶的转录起始和RNA链延伸提供了足够顺利进行的空间；2CBP（CREB Binding Protein）最初是以能结合cAMP应答元件结合蛋白（CREB）而发现的并得此名，实质上，CBP/p300可与多种转录因子结合（核受体及其辅助激活和抑制因子、TBP、TFIIB、P/CAF、Fos/Jun、MyoD、Stat、YY1、E1A、p53、RB等），成为在细胞核内基因转录调控因子间的桥梁，使不同渠道的细胞外信号在细胞核内协同或阻遏基因转录；3.现已发现HAT的底物不限于组蛋白，许多转录因子也可被HAT乙酰化而调节其活性，最为典型的是抑癌基因p53^[15]，其蛋白C端被CBP乙酰化后可加强该蛋白与其调控元件之间的亲和力，从而影响基因的转录。

核受体超家族是一类特异的DNA结合蛋白，它们以同源或异源二聚体识别并结合于甾体激素应答元件（Hormone Response Element, HRE）上，调节靶基因的转录。维甲酸受体和甲状腺素受体等无配体结合时也存在于核内，此时核受体的单独存在对靶基因起负调控作用；当相应配体与之结合后诱导基因转录的上调。近两年来陆续发现甾体激素类辅助激活因子SRC-1和ACTR都具有HAT活性，成为一类新的HAT^[12]。当已结合配体的核受体结合在其元件上，就可募集上述具有HAT活性的辅助激活因子，并可进而再募集CBP/p300等HAT通过染色质调整激活靶基因^[12,16]。无配体存在时，核受体结合在HRE上通过SMRT或N-CoR等核受体家族抑制因子募集组蛋白去乙酰基酶HDAC导致核小体的压缩和转录抑制^[1]。其它抑制性复合体如Mad/Max对E-Box、BCL-6结合在干扰素激活基因应答元件（GAS）时也可募集HDAC并抑制基因转录^[12]。

尽管HDAC一般认为是阻遏染色质活化和基因转录的，有时它们也存在于有转录活性的染色质结构中，可见HAT和HDAC可以共同动态调节活化染色质中核心组蛋白的乙酰化程度。核受体可能通过抑制因子参与负调节或募集HAT起正调控作用，因此它们可以在同一个HSE上选择性地募集HAT或HDAC。近年来发现核受体、YY1、SWI/SNF等转录因子都可结合于核骨架（核基质）上，提示活性染色质与核基质瞬间结合的方式可能决定了上述因子只特异地选择HAT或HDAC中一种酶对染色质结构进行动态调整^[12]。

3DNA甲基化与染色质中基因转录的阻遏

特定细胞中正在转录或具有潜在转录活性的基因都处在开放的染色质中，此时由于核小体相位的影响，基因周围出现DNase I的敏感位点，然而染色质结构的伸展或压缩环境如何建立、维持和调整尚不完全清楚。已知的事实是：“开放”染色质结构较伸展，其中的核小体核心组蛋白呈高度乙酰化，与其协同的DNA中CpG多为非甲基化状态。成年脊椎动物的基因组中60-90%CpG的胞嘧啶可被DNA甲基转移酶修饰。甲基化阻遏基因的转录可能通过CpG胞嘧啶甲基化。直接抑制基础转录器件或特定转录因子如CREB与DNA的结合；此外，90年代初期Bird实验室发现了两种结合于甲基化CpG的蛋白，命名为MeCP1和MeCP2^[1,17]。这种能特异识别甲基化CpG的转录阻遏蛋白为超越DNA甲基化序列的限制而产生广泛远端效应提供了线索。MeCP1结合密集甲基化的CpG区域，其作用显而易见；然而MeCP2尽管只能结合单个甲基化的CpG，它的出现却与甲基化在胚胎发育过程中的作用时相一致。近年来发现MeCP2是一个染色质结合蛋白，它对染色质中甲基化CpG的亲和力远大于的裸露的甲基化DNA位点。它有一个甲基化CpG结合结构域和一个