国外医学遗传学分册1999年第22卷第6期

中国科学院上海生命科学研究中心

中国科学院上海生理研究所（上海200031）

柏邵春赵三虎贺林综述

上海市第一人民医院神经外科

提要肿瘤的发生是具有其分子生物学基础的，自80年代以来许多技术相继开发应用到肿瘤的分子遗传学研究，并取得了显著的成效。这些检测 dNA变异的手段按检测对象分为两类，一类主要用于基因组 dNA的检测，如肿瘤原癌基因和抑癌基因的定位克降、比较基因组杂交、代表性差异分析；用于 cDNA或 mRNA水平的技术包括消减杂交、差异显示 pCR、 cDNA代表性差异分析、 dNA芯片及控针微列阵等。这些技术的应用为肿瘤的分子遗传学研究开拓了一个崭新的领域。

关键词肿瘤分子遗传学；癌基因；抑癌基因

肿瘤是一种进行性的多基因紊乱疾病。恶性肿瘤的死亡率极高。在我国，恶性肿瘤更是各种人类疾病中的头号杀手。探清这一疾病发生的分子生物学基础无论是对肿瘤的早期诊断还是有效治疗，都将带来彻底的改观。自本世纪50年代以来，世界各国就展开了对肿瘤发生机制的探讨，在较长的一段时间内，并未取得大的进展。这与当时技术和研究手段的局限性是分不开的。70年代末，分子生物学尤其是分子遗传学的兴起为肿瘤的研究带来了新的曙光。各种分子生物学手段发明和介入使得肿瘤的研究日新月异。自80年代末期开始，人类基因组计划的实施和遗传学的进步更是大大推动了肿瘤生物学的研究，迄今，已有多种肿瘤的致病基因被相继克隆，如神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等，数个抑癌基因亦被发现和克隆，如 p53,Rb,p16等。所有这些发展与许多先进技术的应用是分不开的。本文就近年来开发的在肿瘤分子遗传学研究领域的新兴技术作一扼要综述。

一、 dNA水平的研究

1．定位克隆癌基因和抑癌基因

利用各种 dNA多态性标记对癌基因或抑癌基因进行染色体定位进而克隆该基因。定位克隆目前主要有两种策略；一是对遗传性肿瘤家系进行连锁分析，将癌基因定位于染色体某一位置再进行克隆。其二，进行染色体杂合缺失的研究，找出某种肿瘤共同缺失的片段，再克隆包含在该片段中的抑癌基因。这两者的共同之处在于首先葡萄肿瘤相关基因的染色体位置信息，再利用物理克隆的手段获得癌基因或抑癌基因。其不同在于前者主要是针对遗传性肿瘤，需要分析携带肿瘤的高发家系；后者则是针对散发性肿瘤。目前常用的 dNA多态性标记是遍布基因组的各种微、小卫星 dNA标记。

对于某种遗传病相关的基因，可通过以上标记物的连锁分析方法确定它在染色体上的位置。目前利用300-400个高度多态性的微卫星标记可以在一个高发的遗传病家系中进行全基因组的扫描，将致病基因定位于10cM以下。乳腺癌基因 bRCA1就是利用连锁分析的方法定位克隆的。1990年美国的研究者利用连锁分析将乳腺癌基因定位于17号染色体上，并发现更准确的位置在遗传标记 d17S579附近。通过对该区域的 dNA片段进行测序后克隆了该基因^[1]。

对于散发性肿瘤来说，人们只能得到肿瘤患者的群体样本。长期的细胞遗传学的研究证实，几乎所有的肿瘤细胞都存在染色体片段的非随机性丢失。这意味着这些丢失的片段中必然包含着某些与肿瘤相关的基因，这就是杂合性缺失（ loss of heterozygosity）的概念。所谓杂合性缺失即一个位点上两个多态性的等位基因中的一个出现初恋或缺失。杂合性缺失在肿瘤细胞中是一种非常常见的 dNA变异。抑癌基因的杂合性缺失会导致肿瘤的发生。利用高度多态性的微卫星 dNA标记在同一病人的肿瘤组织和正常组织对某一染色体区域进行扫描，可以找到与杂合性缺失直接相关的标记，再进一步确定这些标记与抑癌基因间的遗传距离^[2]。对该区域 dNA片段进行候选基因突变分析或直接测序从而确定抑癌基因。在方法上一般是以 pCR扩增微卫星标记的两个等位序列，之后将 pCR产物变性以测序胶分析其单链。通过对比两产物单链的浓度比例即可得出这一位点是否存在杂合性缺失^[3]。利用此方法，检测出在肿瘤的发生中，17p和18q存在很高的杂合性缺失频率，分别达70%和75%之多，但杂合性缺失检测 dNA的突变为定点检测，即在已有的细胞遗传学信息上对某一确定的染色体区段进行检测。而对一些新的研究目标亦可用覆盖整个染色体组的微卫星标记进行全基因组扫描。

上述的两种方法目前一般采用96乃至394孔 pCR板对标记 dNA进行 pCR扩增，再用自动荧光测序仪电泳分离 pCR结果，速度大大高于以前的限制性片段长度多态性标记（ rFLP）和 southern杂交的方法。

2．较基因组杂交

肿瘤细胞 dNA分离得到后可成功地用于检测整个基因组的 dNA缺失或扩增，其中一个有效的方法是比较基因组杂交（ comparative genomic hybridization,CGH）。比较基因组杂交是将肿瘤组织 dNA与正常组织参照 dNA同时在同一套正常染色体上作对比杂交，进而检测出肿瘤细胞 dNA在染色体上发生的缺失或扩增[4]。在 cGH操作中，一般是将不同来源的 dNA进行酶切消化，再以生物素标记肿瘤细胞 dNA，以地高辛标记正常染色体组的参照 dNA，之后将等量的不同标记的肿瘤的 dNA与参照 dNA同时不作任何标记的正常淋巴细胞中期染色体杂交，杂交后的肿瘤组织 dNA以黄颜色的 fITC观测，正常参照 dNA以红颜色的罗丹明观测，肿瘤组织与正常组织在染色体某一位置的杂交量与两样品在此位置的数量直接相关，并且可以通过 cCD相机对杂交后的图谱进行扫描测量红黄两种颜色的对比度加以定量，若肿瘤 dNA在某位置存在缺失，则该位置为红色；若有抗增，则观测到混合色即绿色。在 cGH中，参加 dNA是作为特定位置的变异的正常对照，因此，肿瘤细胞在整个基因组染色体水平的扩增或缺失都可以通过两种荧光染料的对比度加以确定。

cGH应用于肿瘤遗传学的研究，可以提供一个全基因组的“扫描图”，形象地表现出肿瘤 dNA在整个染色体组的哪个特定位置存在缺失，这些部位即可能包含一些抑癌基因^[5]，而哪些位置发生了扩增，而这些位置极可能存在致癌基因。至今以此方法已发现了多种肿瘤在肿瘤的某些位置存在高频率的变异，如18q的一位点发生了肺癌的抑癌基因缺失，并且现在发展了将某一类肿瘤的多个样本的 dNA定量合（ pool）之后以 cGH分析，这样可以发现某类肿瘤在染色体水平的所具有的类同的变异，从而就有可能找到这类肿瘤发生的根本原因。

3．代表性差异分析

在肿瘤的发生过程中，体细胞发生遗传物质丢失或重排的频率是非常高的。代表性差异（ representional difference analysis,RDA）可用于检测两种不同 dNA群中所存在的序列上的差异^[6]。由于人类基因组 dNA的复杂性，一些常规的方法并不能大量和快速地使被检 dNA序列上的差异信号富集和扩大化，这就限制了这些技术的灵敏性和有限性， rDA则有效地克服了这个缺点， rDA中涉及的两套 dNA分别称为检测 dNA（ tester dNA）和驱动 dNA（ driver dNA）。首先将两套 dNA以几种内切酶作用，然后加上共同的接头（ akaptor），以 pCR作初步扩增。许多分子量小于1kb的片段被丰富扩增，这些扩增产物称为扩增子（ amplicon），多种内切酶综合使用，即可制备覆盖全基因组的扩增子。两套不同的扩增子制备完毕后，与前边制备的驱动 dNA的扩增子进行杂交，然后以杂交产物为模板，以互补于接头的序列为 pCR引物进行筛选扩增。在这一步 pCR扩增反应中，只有那些自身得以复性的检测 dNA扩增子具有 pCR引物的结合位点而被扩增，而自然复性的驱动 dNA扩增子与那些两种 dNA形成的异源双链 dNA则不能被扩增，实际上在整个扩增过程中，驱动扩增子的竞争性结合抑制了检测扩增子的再扩增。

RDA用于检测肿瘤样本的 dNA变异时，可以将两种 dNA中的任何一种作为驱动 dNA，另一种作为测试 dNA。将肿瘤样本的 dNA作为检测 dNA，而将正常基因组的 dNA作为驱动 dNA，通过杂交复性，没有突变的部位都可以与正常的驱动扩增子单链复性结合而使这些部分不被扩增，而存在突变的位点只能与自身的肿瘤 dNA结合复性，这样的双链肿瘤 dNA被再扩增，因此得到的扩增产物极有可能即是发生了遗传突变的序列即抑癌基因，反之则可以得到癌基因。

二、 rNA水平的研究

1．消减杂交

消减杂交（ subtractive hybridization）主要是检测肿瘤细胞与正常细胞间 mRNA水平上的差异。它是80年代初期兴起的一项分子生物学技术，迄今已在分子生物学的许多领域证实了其可行性，应用于肿瘤的分子遗传学领域，消减杂交可以用于抑癌基因或致癌基因的筛选^[7]。筛选抑癌基因时，正常组织 cDNA以1:10的比例与肿瘤的 mRNA杂交，之后去除异源双链杂交体，将剩余正常组织的单链 cDAN再以1：10的比例与肿瘤的 mRNA进行第二轮杂交，依此筛选，最后剩余的未能与肿瘤 mRNA复性结合的单链 cDNA作克隆测序分析，这些序列无法与肿瘤的 mRNA互补结合，故极有可能是因为肿瘤细胞的 mRNA在这些部分发生了变异，而这些变异构成了肿瘤的形成，这些序列中便可能包含有抑癌相关基因，反之，筛选致癌基因时，则以十分之一比例的肿瘤 cDNA与正常组织 mRNA进行筛选杂交。

2．差异显示 pCR

差异显示 pCR技术（ differential display PCR,DD-PCR）是在1992