中华神经科杂志

CHINESE JOURNAL OF NEUROLOGY

1999年第32卷第3期Vol.32No.31999

张成潘速跃 刘焯霖

关键词：迪谢内肌营养不良（DMD） 基因 遗传

迪谢内肌营养不良（DMD）是一种常见的致死性神经肌肉系统X连锁隐性遗传病，发病率为活产男婴的1/3 500。患者一般3～5岁发病，主要表现为全身骨骼肌进行性无力、萎缩和小腿腓肠肌假性肥大，随着病情加重，20岁左右因呼吸衰竭死亡，迄今无有效的治疗方法。1987年Kunkel等将该基因cDNA克隆，继之测序及确定其蛋白产物，为DMD的研究开创了新纪元。我国自1987年开始对DMD的分子遗传学进行了研究，在基因结构、基因产物的分析和基因诊断等方面取得了一定的成果，现简述如下。

一、基因结构的研究

1. 基因全顺序的人工酵母染色体（YAC）克隆：柴建华等^［1］用DMD cDNA探针从YAC文库中筛选出5个YAC克隆，经用HindⅢ酶切和DNA印迹杂交分析，确定各YAC克隆相互部分重叠，并包含从5′至3′端基因的完整顺序，其基因组长度大约为2 500 kb。

2. 大尺度限制性酶图谱研究：绘制了上述5个YAC克隆DNA的Mlu Ⅰ、Cla Ⅰ和Sfi Ⅰ酶切图谱^［2］。在1～48号外显子1 380 kb的区域中，有7个Mlu Ⅰ 切点，3个Cla Ⅰ 切点。从5′到3′端，Mlu Ⅰ片段的排列是400 kb、240 kb、50 kb、280 kb、120 kb、80 kb，Cla Ⅰ片段的排列是250 kb、300 kb, Sfi Ⅰ的酶切图谱与国外报道的相似。余龙等^［3］研究了抗肌萎缩蛋白基因3′端的分子结构，在该基因的3′末端发现了一个新的725 kb Sfi Ⅰ片段；用DMD cDNA9～14片段制备了16个相邻部分重叠的亚探针，系统地研究了该基因3′端Hind Ⅲ片段的数目和排序，证明了3′末端的Sfi Ⅰ/IJ片段至少含17个Hind Ⅲ片段或19个外显子。魏勇等^［4］应用Alu-PCR指纹技术发现了两个YAC克隆构成了包含DXS166位点的重叠群，这一发现使得以上YAC重叠群至少延伸至DXS166位点，形成了1个跨度为3.5 Mb的YAC重叠群。

3. 精细限制酶图谱及外显子的定位^［5］：用DMD cDNA8探针，从人X染色体噬菌体文库中筛选出目的克隆。将该克隆DNA用Eco RⅠ、Hind Ⅲ和Kpn Ⅰ部分酶切，λ噬菌体左右臂探针杂交，首次绘制抗肌萎缩蛋白基因在51外显子及其两侧的精细限制酶图谱。在13 kb的插入片段中，有3个Kpn切点，4个Eco RⅠ切点，5个Hind Ⅲ切点。根据Kpn Ⅰ酶切位点的位置，将51号外显子准确定位于3.1 kb Hind Ⅲ片段的中央。

4. 50号和51号外显子的克隆和测序^［6，7］：将该Hind Ⅲ片段经限制酶完全酶切后亚克隆于pUC118中， 所获得的亚克隆进行全序列测序。结果发现，50和51号内含子AT含量高达70%以上，呈聚集性分布，并存在有36个n为5～20的短串联重复序列，22个正向和反向重复序列，和8个同源序列。

5. DNA缺失的可能机制^［8］：根据50、51号内含子结构的以上特点，我们首次提出不同内含子中AT富集区的重复顺序与DNA缺失有关。为验证以上观点，分析了另一缺失热点（44号内含子）254 bp的序列特点，结果发现，该内含子AT含量为63.6%,与50号内含子和51号内含子均存在重复顺序，以上结果支持我们的观点。由于发生重组的同源顺序的位置，决定了缺失断裂点的部位，这就很好地解释了为什么缺失断裂点并不固定于某一特定的序列，为什么缺失范围大小不一。

二、 基因诊断

目前我国许多单位均已开展了基因诊断，进行DMD患者、携带者检测和产前诊断。最早开展此项工作的是曾溢滔，他在运用RFLPs和PCR技术作基因诊断方面做了大量的工作。其他如DNA印迹杂交、定量PCR、RT-PCR等基因诊断方法亦得到了开展。

1． 患者的诊断：早期主要应用DNA印迹杂交法进行DMD基因诊断，该方法的检出率取决于所用的探针。以C7、87-15、87-30、87-8、87-1、X.J 1.1、X.J 2.3、J.Bir为探针可检出20%的DMD患者有缺失^［9］，cDNA1-2a、cDNA2b-3探针检出缺失率为20%^［10］，cDNA5b-7、8、9、10探针检出缺失率为48%^［11］，缺失主要集中在cDNA8探针所在部位。全序列cDNA探针检出缺失率为55%～65%。

DNA印迹杂交法由于耗时长、技术要求高，限制了它的应用。随着PCR技术的成熟，很快PCR技术就成为了诊断DMD的主要手段。PCR技术简单、快速，尤其是多重PCR，为缺失型DMD/BMD患者的诊断提供了一种很好的手段。Chamberlain等设计的9对引物可检测出80%的缺失患者；Beggs等增设了另9对引物，这18对引物可检测出98%的缺失患者。18对引物多重PCR检测在国内报道不多，杨军等^［12］用18对引物检测了17例DMD患者，结果9例有缺失。高文英等^［13］以18对引物检测了37例DMD/BMD，检出缺失患者19例。我国由于条件限制，大部分研究均采用二步9对引物多重PCR检测DMD/BMD患者。汪江等^［14］用9对引物检测了134例DMD/BMD患者,检测阳性率为49.3%。据我们对274例国内资料分析，我国9对引物多重PCR的总检出率为47%。其中5对引物(12、17、45、48、51号外显子)的总检出率为46%，占9对引物检出率的96%。

对点突变的研究，由于DMD患者外显子多、点突变率低，国内仅王柠等^［15］应用PCR-SSCP技术在17号外显子上发现1个由G向T的颠换。

另外，RT-PCR用于诊断缺失^［16］和定量DNA印迹杂交技术^［11］用于诊断重复，国内亦见有文献报道。

2． 携带者诊断: 最早主要是利用RFLP技术。曾溢滔等^［9］以C7、87-15、87-30、87-8、87-1、X.J 1.1、X.J 2.3、J.Bir为探针发现95%携带者的RFLP是杂合的。陈凡等^［17］利用754、pERT87-8、P20为探针在8个资料完整的DMD家系25名女性中确定11名为携带者。魏建军等^［18］研究了9个DMD基因探针的多态频率，发现pERT87-7、X.J 2.3、X.J 1.1三探针组合可检出90%的女性出现多态位点。许顺斌等^［19］利用PCR技术扩增5′和3′非翻译区两个CA重复序列，发现5′CA重复序列具有6种等位片段，频率为0.033～0.267，多态信息量（PIC) 0.75。3′CA重复序列有两种等位片段，频率为0.75、0.25，PIC 0.375。应用以上位点对非缺失型DMD家系进行连锁分析，诊断携带者1例。RFLP技术的优点是可对基因型不明确的DMD家系进行携带者和产前诊断，但存在以下缺点：(1) 技术难度相对较大，需要DNA样本量大，耗时长；(2) 虽然与PCR技术结合在一定程度上简化了RFLP技术，但RFLP技术需要完整的家系资料；(3) 有可能因染色体重组而造成误诊，由于抗肌萎缩蛋白基因的基因内重组率高达10%，因而其误诊率可能是不容忽视的。

定量DNA印迹杂交亦能用于检测携带者，但同样由于耗时长、技术难度大，很难普及推广。

我科于1996年开展直接定量PCR法检测缺失型DMD基因携带者，对4个缺失型DMD家系中的11名女性家属检测结果显示，6名女性为携带者^［20］。直接定量PCR检测携带者敏感性高、快速、简便。但对照位点和缺失位点的引物之间不能有互相影响，首先必须确定对照位点和缺失位点扩增产物的产量在PCR对数扩增期是相等的或具有某一线性关系。

3. 产前诊断: 国内主要采用RFLP和PCR方法进行产前诊断。曾溢滔等^［9］利用RFLP技术成功确定1例胎儿为DMD患者，1例女性胎儿为携带者，结果经流产或分娩验证。高百红等^［21］利用PCR技术扩增pERT87-15区域DNA，经Xmn Ⅰ酶切，发现5个家系中2个可行产前诊断和携带者诊断。通过取胎儿绒毛组织或妊娠中期羊水细胞制备DNA，经PCR检测能对先证者为缺失型DMD患者的胎儿进行产前诊断。华小云等^［22］对10名DMD高危胎儿以多重PCR进行产前诊断，结果7名男性胎儿中有3例为DMD患儿，3名女性胎儿中有1例为携带者，以上结果经出生后复检证实。吴元清等^［23］以14对引物多重PCR方法对6例先证者为缺失型的高危胎儿进行产前诊断，结果发现4例为DMD患者。

三、 基因产物——抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的研究

1. 抗肌萎缩蛋白的疏水结构^［24］: 为了探讨DMD的发病机制，我们对抗肌萎缩蛋白进行了疏水性分析，首次发现在95～120,1 990～2010,2 438～2 493和3 150～3 300位氨基酸有疏水峰出现，其中第三个疏水峰的疏水性最强，位于缺失热区51外显子的编码区内，疏水氨基酸占54%,远较整个蛋白中疏水氨基酸的比例（26%）为高。

2．疏水结构与DMD/BMD的关系^［25］: 为验证缺失热区疏水结构的重要性，我们分析了65例整码缺失DMD和136例整码缺失BMD患者，发现75%的整码缺失DMD患者丢失该疏水肽段，98%的BMD患者保留有该疏水肽段，提示该疏水肽段是抗肌萎缩蛋白的一个重要功能区，它的存在与否直接影响疾病的预后。Monaco曾提出“移码突变”导致DMD，整码缺失导致BMD。这一假设已广为接受，并受到了许多研究的验证，但有8%的例外。我们的发现是对以上假设很好的补充。

3. 蛋白的表达和抗体的制备: 抗肌萎缩蛋白基因的表达是DMD国际研究热点之一，对研究该蛋白的结构和功能，以及制备相应的抗体用于蛋白诊断均具有重要的意义。颜真等^［26］将抗肌萎缩蛋白基因cDNA 5 824～7 007 bp基因<