中华神经科杂志

CHINESE JOURNAL OF NEUROLOGY

1999年第32卷第3期Vol.32No.31999

王柠 吴志英 慕容慎行

关键词：脊髓性肌萎缩症(SMA) 基因缺失

脊髓性肌萎缩症(SMA)系指一类由于脊髓前角细胞变性导致近端肌无力、肌萎缩的疾病。根据起病年龄和病变程度可将本病分为4型^［1］。Ⅰ～Ⅲ型称为儿童型SMA，属于常染色体隐性遗传病，群体发病率为 1/6 000～1/10 000，携带者频率为1/40～1/60,是婴儿期最常见的致死性遗传病，也是儿童期第二常见的神经肌肉疾病，发病率仅次于迪谢内肌营养不良症。Ⅳ型称为成人型SMA，常于30岁后起病，群体发病率约0.32/10 000。我们就SMA的分子遗传学最新研究进展及其临床应用情况作一介绍。

NAIP^Ψ：NAIP假基因拷贝；cen：着丝粒侧；tel：端粒侧；箭头指示1号外显子→8号外显子方向

1 5q 13区域基因结构模式图

一、临床表现及基因定位

Ⅰ型SMA(Werdnig-Hoffmann病)称为严重型，出生后6个月内起病，患儿无法坐立，通常在2岁以内死亡。Ⅱ型SMA又称为中间型, 出生后6～18个月内起病, 患儿能坐，但无法站立和行走,存活期视呼吸道并发症的情况而定，但超过2岁。Ⅲ型SMA(Kugelburg-Welander病)于出生18个月后起病,患儿能独立行走,病情进展缓慢,可存活至成年。临床诊断标准见文献［1］。

1990年，Ⅰ～Ⅲ型SMA基因首次被定位于5q13^［2］。1993年以来，该区域许多新的微卫星多态被发现，从而将其精确定位于D5S435和MAP1B之间不足0.7厘摩范围内。1994年Melki等采用人工酵母染色体(YAC)技术分离到探针C212和C272，在少数Ⅰ型患者中检出基因缺失，提出缺失是SMA基因突变的重要形式。DiDonato等则发现AgI-CA多态位点与Ⅰ型SMA密切相关, 提示该区域内可能存在不同形式和不同程度的基因突变。Brahe等^［3］和Clermont等^［4］研究表明，Ⅳ型SMA的常染色体隐性类型与儿童型SMA具有同质性，亦与5q13紧密连锁。

二、SMA的候选基因及其结构

5q13区域结构高度复杂，存在许多重复序列，可导致基因重排和不稳定；且该区域包含众多假基因簇，可产生类似但无功能的mRNA产物^［5］。这些对SMA基因克隆造成巨大困难。

1995年,不同的研究小组分别报道了3个SMA候选基因。法国Lefebvre等^［6］在5q13.1区域发现了运动神经元生存(survival moter neuron, SMN)基因，全长约20 kb，含8个外显子，其转录产物约1.7 kb，编码294个氨基酸，功能未知。在一条染色体上该基因具有两个拷贝，二者间有5个碱基的差别，在端粒侧称SMNt，着丝粒侧称SMNc。研究表明，SMNt第7、8号外显子在98.6%(226/229)SMA患者中纯合缺失或截断，另1.4%(3/229)患者有小缺失或点突变，而246名对照正常。其他作者对不同种族SMA患者的研究结果亦表明，90%以上SMA患者缺失SMNt基因^［7-9］。此外，在5%～10%未发生上述变化的患者的SMN基因中检测到众多的小片段缺失和点突变^{［6,7,10,11］}。这些均强烈支持SMN是SMA重要的决定基因。Roy等^［12］在5q13区域另克隆到神经细胞凋亡抑制蛋白(neuronal apoptosis inhibitort protein，NAIP)基因，有16个外显子，全长70 kb，编码1 232个氨基酸。45%（17/38）Ⅰ型SMA和18%（13/72）Ⅱ、Ⅲ型SMA患者存在NAIP基因第5、6号外显子缺失，而2%的正常对照亦缺失5、6号外显子，提示NAIP基因亦与SMA发病相关。SMN和NAIP基因的结构和位置关系见图1。

第三个候选基因是BTF2p44,编码转录因子TFIIH的一个亚单位。在部分Ⅰ型SMA患者中可检出BTF2p44基因缺失，但其表达的蛋白结构和功能却正常，提示该基因在SMA病情发展过程不起重要作用,故目前倾向于BTFp44不是SMA的致病基因^［13］。

三、SMA的分子发病机制

目前众多遗传学证据已表明SMN是SMA的决定基因，不仅大多数SMA患者可检出SMNt缺失^［7-9,14］，且其缺失的程度和范围与SMA临床表型的严重程度密切相关^［15］。Velasco等^［16］对65个来自西班牙的SMA患者进行SMN基因第7、8号外显子及NAIP基因第5号外显子的缺失检测,发现92.3%缺失SMNt基因，67.9%的Ⅰ型SMA患者缺失NAIP,且大部分缺失NAIP者均缺失SMNt。由图1可见，正常SMN与NAIP的位置关系为:SMNt 7号外显子→SMNt 8号外显子→NAIP 5号外显子,病情严重者，缺失范围由SMNt向NAIP方向扩展。

除了基因缺失外，许多学者注意到SMNt转化为SMNc可能是SMA发病的另一重要机制。Rodrigues等^［15］对187个SMA家系的研究发现，Ⅱ、Ⅲ型SMA可混合存在于一个家系，但极少与Ⅰ型混合，提示Ⅱ、Ⅲ型可能为统一体。Velasco等^［16］亦发现1例Ⅱ型SMA患者缺失NAIP基因，却保留SMNt的第7、8号外显子；2例SMA患者(分别为Ⅰ型和Ⅱ型)缺失NAIP基因的第5号外显子和SMNt基因的第7号外显子, 但保留SMNt的第8号外显子。可能的解释是，他们虽检测到NAIP和SMNt缺失现象, 但实际上SMNt并未缺失而是转化形成了SMNc。由于SMA患者的父母为肯定携带者，其两条染色体仅拥有一个拷贝的SMNt, 因此SMNc∶SMNt的浓度剂量比值即为SMNc的拷贝数。Velasco等^［16］进一步测定了SMA患者父母的7号外显子SSCP条带浓度，并计算SMNc∶SMNt浓度剂量比值。结果发现，50%的Ⅰ型SMA父母各有两个拷贝的SMNc（即每条染色体1个SMNc）,而66.5%的Ⅱ型SMA及75%Ⅲ型SMA的父母各具有至少3个以上拷贝的SMNc基因, 这表明基因缺失是Ⅰ型SMA致病的主要原因, 而Ⅱ、Ⅲ型SMA以SMNt基因转化成为SMNc更常见。

1997年, Campbell等^［17］应用脉冲电泳技术直接检测SMNt和SMNc基因的拷贝数, 发现Ⅰ型SMA患者只有1～2个SMNc拷贝,而Ⅱ、Ⅲ型SMA患者有2～4个SMNc拷贝，指出在Ⅱ、Ⅲ型SMA患者中，原来认为缺失的SMNt基因并未缺失, 而是转化成SMNc基因, 使SMNc拷贝数目增加。从而提出SMA的2种致病机制:(1)Ⅰ型SMA主要由于大片段缺失引起,缺失范围大于70 kb, 包括SMNt和NAIP基因^［17,18］。 (2)Ⅱ、Ⅲ型SMA的发生多与SMNt基因转化有关。少数SMA患者，其父母及同胞检出SMNt基因缺失^［19］，但无临床症状，主要也是由于基因转化导致SMNt被SMNc取代, 使这些个体具有4个拷贝的SMNc基因型。由于SMNc基因可转录成一定水平的功能蛋白^［6,20］，4个拷贝的SMNc基因将产生足够的功能蛋白,使这些个体表型趋于正常。因此，某些情况下，基因缺失、转化或不对等交换均可导致部分SMNt基因被截断、反转或与SMNc末端连接，这种基因产物的变异体可能具有减轻症状发生的作用。有关SMN基因缺失和转化模式参见图2、3。

1、2表示两种正常等位状态，即SMNc缺失(占少数)和SMNc存在图2 正常人SMN等位基因模式图

1、2：SMNt基因缺失；3、4：SMNt转化成为SMNc

3 SMA患者SMN等位基因模式图

四、SMN基因表达及其与SMA表型的关系

SMN基因编码1个包含294个氨基酸的蛋白，分子量为38 000。研究表明, SMN蛋白可与剪接体（spliceosomal）snRNP蛋白结合，参与后者的生物遗传作用^［21,22］；此外，应用免疫印迹和免疫组化技术研究发现，SMNt和SMNc基因均可转译成相应的蛋白，且两者具有相似的迁移率, 在所有Ⅰ型SMA患者中, SMNt蛋白的相对水平均显著减少,Ⅱ型患者中部分减少，部分正常，在Ⅲ型SMA中则无明显改变。而且上述改变与邻近的NAIP及p44基因的缺失无关。因此，SMN蛋白分析为SMA的分子水平分型提供了重要依据^［20］。

SMA胎儿组织(肝脏和脊髓)分析表明，SMNc蛋白在Ⅰ型和Ⅲ型SMA均有减少,且Ⅰ型患者减少程度大于Ⅲ型^［20］，但在正常胎儿组织未见上述现象，提示SMNt和SMNc基因产物的表达或稳定性不同，这些资料解释了SMNt基因缺失或突变可产生SMA表型，而缺乏SMNc则无明显的表型效应。

虽然目前SMN蛋白的功能尚未完全清楚, 但已证实它在RNA代谢中起重要作用^［23］。对SMN蛋白特征的进一步研究将有助于阐明SMA发病具有组织特异性的特点，进一步建立动物模型则有助于建立基因治疗的新方法^［14］。

五、临床应用

SMNt基因的高缺失(转化)频率使直接检测基因缺失方法诊断SMA成为可能。由于SMNc在95.5%对照个体存在, 妨碍了对SMNt缺失的检测, 但是SMNt和SMNc具有5个碱基差异, 其中2个分别位于第7、8号外显子, 通过单链构象多态分析(SSCP)技术可加以区分^［6］。van der Steege等^［8］根据SMNc的第7、8号外显子分别存在DraⅠ和DdeⅠ切点,而SMNt无此酶切位点的特性，建立了PCR-酶切方法，不需进行SSCP电泳,结果清晰,