生物化学与生物物理进展1999年2月第26卷第2期

军事医学科学院放射医学研究所，北京100850

林汝仙王升启

摘要病毒性肝炎的治疗一直是困扰人类的一个难题。目前可利用的药物仍屈指可数．反义核酸技术的发展为病毒性肝炎的治疗带来了新的希望。利用反义 dNA，反义 rNA和核酶技术来抑制乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒，在体外已进行了大量的研究，体内也进行了一些研究，为临床应用反义核酸治疗病毒性肝炎奠定了基础。

关键词反义核酸，抑制，肝炎病毒学

科分类号 q75， r512.6

病毒性肝炎是人类与其长期抗争的恶魔，迄今已发现有7种类型。由于病毒性肝炎的传染性强，尤其是乙型及丙型病毒性肝炎可形成慢性感染，造成肝细胞的持续损伤，加重肝脏病变，常导致病情反复发作，长期迁延不愈，部分病人可发展成肝硬化和肝癌，危害极大。近年来，对病毒性肝炎的研究有较大的进展，但能有效治疗病毒性肝炎的临床药物仍屈指可数，尤其是对慢性乙型及丙型病毒性感染，临床可用的药物仍是各型干扰素，对有选择性的病人来说，其治愈率也只有30％～40％^［1］。因此寻找一种有效的抗肝炎病毒药物已成为迫在眉睫的问题。

由于病毒的遗传物质不同于宿主细胞，从基因治疗的角度去发现新的抗病毒药物已成为近几年来的研究热点。反义核酸技术是一种新的基因治疗技术，包括反义寡核苷酸（ aSON），反义 rNA（ asRNA）及核酶三大部分。反义寡核苷酸是一段反义的 dNA序列，能与特异性的靶序列互补，抑制靶基因的表达。由于它特异性强，毒副作用小而成为人们研究抗病毒药物的热点。近几年来已有几种抗病毒反义寡核苷酸药物进入临床试验阶段。反义 rNA是指一段与 mRNA互补的 rNA分子，是通过将正常 cDNA反向插入到启动子下游后转录产生的。核酶是一种小的 rNA分子，能以序列特异的方式在特定的位点断裂 rNA分子，从而阻断特异蛋白的表达。核酶的抗病毒作用也引起了研究者的广泛兴趣和关注。本文主要对近几年来应用反义寡核苷酸，反义 rNA和核酶技术抗肝炎病毒的研究进展作一简要综述。

1反义核酸抗乙型肝炎病毒

病毒性乙型肝炎（ hBV）以其感染面广，慢性化和难以治愈而成为临床治疗的难点。目前，全世界约有3亿人感染 hBV，我国乙型肝炎病毒表面抗原（ hBsAg）的携带率占全国人口的9.8％，占全世界感染者的1／3强。干扰素是目前临床上唯一可用于治疗 hBV感染的药物，但治疗效果不好，随着反义寡核苷酸技术的产生和发展及对 hBV基因结构，功能和复制等主要环节的认识和了解，应用 aSON来抑制 hBV基因的复制和表达在体外已进行了大量的研究，体内也进行了一些研究。体外研究主要采用转染了 hBVDNA并能长期稳定分泌病毒的肝癌细胞系进行的（ hepG2， huh7等）。分别针对 hBV基因的吸附、转录、反转录、翻译和包装等阶段设计出各类 aSON，体外抑制 hBV的复制．主要的靶部位有 preS、 dR1、 pol、 sP启动子转录 mRNA帽区、 s基因、 c基因、 polyA增强信号区、 rNA前导序列等，针对这些部位设计的 aSON均能不同程度的抑制 hBsAg， hBeAg或 hBcAg的表达，对病毒 dNA也具有不同程度的抑制作用^［2，3］。 korba等^［4］针对以上不同部位合成了56条不同的硫代 aSON（14～23nt），分别检测了它们对 hepG2.2.15细胞中 hBsAg， hBeAg， hBcAg及 hBVDNA的抑制效果，结果表明：包含 s基因起始编码子的 aSON均能有效抑制 hBsAg的产生和病毒颗粒的释放，但不影响细胞内 hBV的复制；针对 c基因的 aSON能抑制病毒颗粒的产生和细胞内 hBcAg和 hBVDNA复制中间体的水平；针对 hBV包装信号的茎环结构上游的 aSON能最有效的抑制 hBV的复制，但针对 hBeAg和 hBV聚合酶基因区的 aSON却不能影响 hBV的复制。 goodarz等^［5］针对 hBV基因 s区的5个位点（ sP2启动子转录 mRNA帽区， pre-s2基因内部， s基因翻译起始区， s基因起始区下游10个碱基区和 s基因内部）设计了6段 aSON，以17.4μ mol／ l的终浓度与 pLC／ pRF5共同孵育72h后检测 hBsAg的分泌量，结果发现，针对前4个位点设计的 aSON对 hBsAg有明显的抑制作用，其中以 s基因翻译起始区的作用最强，抑制率达96％。我国姚志强等^［6］的研究也表明针对 hBVmRNASP2增强子帽区， polyA增强信号区的硫代 aSON能有效抑制 hBsAg的产生，抑制率达85％～90％，对 hBeAg的抑制率也近50％～60％。国内还有其他一些单位也展开了类似的工作。由于缺乏一个很好的动物模型，对抗 hBV反义寡核苷酸的体内作用研究进展较慢。1993年， offensperger等^［7］第一次用针对 preS基因5′区的反义寡核苷酸 aS2以20μ g每克体重的剂量腹腔注射到鸭肝炎病毒（ dHBV）感染的北京鸭中，连续10d， dHBV的复制几乎被完全抑制，血清中的 dHBsAg及肝中的 hbcAg也消失了。 moriya^［8］等用一个转染了的 hBVX基因的肝癌小鼠做模型，将一段含 hBVX基因起始编码子的硫代 aSON腹腔注射到小鼠体内，每周3次，连续8周，能有效的抑制肝脏 hBVX基因的表达，阻止小鼠癌细胞恶性化。这一研究表明针对 hBVX基因的 aSON也许可用于阻止 hBV感染成肝癌。

aSON的稳定性及透膜性是影响 aSON作用的一个重要因素．通过对 aSON进行各种化学修饰能有效地提高它在细胞内的稳定性，这些修饰主要是对磷酸二酯键中的氧原子进行各种取代，包括用硫基、甲基、甲氧基、乙氧基等取代，以提高 aSON对核酸酶的抗性，硫代是目前最常用的修饰方式。 aSON的透膜性直接影响到细胞摄入 aSON的量，因而是目前进行 aSON研究的一个热点。在肝细胞的表面有独特的无唾液酸糖蛋白受体（ aSGP-R），将 aSON连接到 aSGP-R配体上，能定向地将 aSON导到肝细胞，增加肝细胞对 aSON的摄取量^［9］。目前人们已对许多肝细胞特异的 aSON载体进行了研究^［10］，这为更进一步地进行反义寡核苷酸的体内和临床研究奠定了基础。由于反义 rNA能在转染的细胞中连续、稳定地表达，对整合的病毒能提供长期的治疗效应，因此这一技术也被用于抑制 hBV的复制． wu等^［11］构建了三个互补于 hBsAgmRNA整个编码区（1.4kb），1.0kb和5′区的582bp的反义 rNA表达质粒，在体外翻译系统，三个反义 rNA均能以浓度依赖的方式抑制 hBsAgmRNA的翻译，进一步将其克隆到哺乳动物细胞表达载体上，转染到 hep3B细胞，几乎完全阻抑了 hBsAg的产生，转染后抑制率持续10个月左右。在反义 rNA表达的细胞， hBVmRNA的水平显著低于对照细胞，这表明反义 rNA抑制 hBsAg合成部分可能是通过降低 hBVmRNA水平而起作用的。这一研究第一次证明了反义 rNA对 hBV基因表达的抑制作用，也为治疗 hBV感染提供了一条新的途径。

利用核酶抑制 hBV在体外也进行了一些研究。 beck等^［12］针对 hBV基因设计了几个锤头型核酶，在体外能有效的断裂 hBV基因。将 hBV表达质粒和核酶共转染到 huh7细胞中，发现在细胞内核酶只能中等程度抑制 hBV前基因组的产生，而当细胞裂解后，核酶能有效的断裂 hBV前基因组 rNA，尤其当用蛋白酶 k和酚抽提后，核酶的活性大大提高，这可能是由于细胞内存在着一些蛋白质，与基因结合，从而抑制了核酶与靶 rNA的杂交；另外，细胞内 mg2＋的浓度太低也可能是影响核酶活性的一个原因．总之，核酶在体内的活性是一个很复杂的问题，仍需进行大量的研究。

2反义核酸抗丙型肝炎病毒

丙型肝炎病毒（ hCV）为一正的单链 rNA，与乙型肝炎病毒感染一样， hCV感染也易慢性化，并进一步发展成为肝癌．估计世界上约有1％的人感染了 hCV，20％～40％的病人将发展成肝硬化或肝癌。目前临床上可用于治疗 hCV感染的较有效药物也只有干扰素。

由于 hCV基因的变异性较高（同源性在67％左右），其变异性被认为是感染复发率高的一个原因^［13］，而其5′非编码区（5′ noncodingregion，5′ nCR）是高度保守的（92％～100％的同源性），因此抗 hCV的 aSON大部分是针对这一部位设计的． wakita等^［14］首先研究了 aSON抗 hCV的作用．他们针对 hCV5′ nCR的 nt38～65，134～175，312～339合成了三段 aSON，在一个无细胞蛋白质合成系统中，能有效抑制病毒蛋白的翻译，表明这些区域对 hCVRNA的翻译是重要的，但由于缺乏一个很好的细胞模型，这些 aSON在细胞内的作用仍不请楚． mizutani等^［15］发现一个嗜人 t淋巴细胞病毒Ⅰ型（ hTLV-1）感染的细胞系 mT-2能支持 hCV的复制．他们用 mT-2的研究表明：针对 hCVC基因含起始编码子的一段 aSON（342～361）及其下游的一段序列（346～363）均能特异地抑制 hCV的复制，而针对起始编码子上游的一段序列（321～340）则只有轻微的抑制作用． alt^［16］的实验也表明，针对 hCV5′ nCRnt326～348的硫代反义核酸，在体外能有效抑制受 hCVRNA5′ nCR调控的报告基因荧光素酶的活性，当浓度为4.14μ mol／ l时，抑制率达96％．利用核酶抑制 hCV的复制体外也进行了一些研究． lieber等^［17］针对 hCV5′端的高度保守区设计了6个锤头型核酶，用重组的