中华神经科杂志

CHINESE JOURNAL OF NEUROLOGY

1999年第1期No.1 1999

武勇琴 吕传真

关键词：差别显示聚合酶链反应(DDPCR) 神经系统疾病 基因表达

差别显示聚合酶链反应(DDPCR)^［1］，又称差别显示反转录PCR(DDRT-PCR)^［2］，或mRNA差别显示法，是Liang等^［1］1992年建立的一种以PCR为基础的、能快速有效地鉴别并克隆一对组织或细胞间差别表达的基因的方法。时至今日，短短几年间，该技术已广泛应用于分子生物学研究的各个领域，如基因调控、信号传导、细胞凋亡、细胞对药物和基因治疗的反应等。在对多种疾病，如乳腺癌^［3］、糖尿病^［4］、心脏病^［5］及神经系统疾病等的研究中，通过这一方法找到了许多疾病相关基因，甚至是新基因，大大丰富了我们对复杂生命过程的理解。

一、背景及历史回顾

高等生物一般具有十万个基因，但单个细胞仅表达其中的15%，约15 000个基因。基因表达的选择性决定了生命的全过程，如发育分化、稳态、细胞凋亡及细胞对损伤的反应等^［1］。正常发育过程或病理变化，无论是单基因突变还是多基因的综合作用，本质上都是基因表达改变所致。同时显示并比较一对细胞或组织的信使核糖核酸(mRNA)，可找到两者间的差异表达基因，为我们进一步理解生命的本质提供信息。

传统分析基因表达的方法^［6］：cDNA文库差别筛选(differential screening)和减数cDNA文库(subtracted cDNA libraries)的构建。这两种方法的技术难度大、耗时多，均要求构建高质量的有代表性的cDNA文库，只能比较给定时间点一种方式的基因表达，所以只能检测出组织中表达相当高的基因，而且,减数杂交只能显示翻译过程中变化较大的基因。DDPCR在既往研究的基础上，经合理设计能系统的比较不同组织和细胞间mRNA的表达，在一定程度上克服了传统方面的不足。

二、原理

DDPCR的基本原理：利用随机引物扩增所有的mRNA，并通过测序胶电泳显示出大小不同的条带。其依据：绝大多数真核细胞的mRNA 3′端均有polyA尾^［7］，表现为5′…M′N′AAAn 3′(M代表A、G、C、T，N′代表G、C、T)，M′、N′ 随机组合只有12种mRNA，用人工合成的 (Oligo-dT+MN即T12MN，M代表A、G、C，N代表A、G、C、T作为3′ 端引物，分别对总RNA进行反转录，可获得1/12的cDNA亚群，然后用5′端随机引物对cDNA亚群进行PCR扩增，因5′端引物与cDNA结合是随机的，因此，来自不同mRNA的扩增产物大小也不相同，经测序胶电泳可显示差异表达的cDNA片段。重新扩增并克隆这些片段，用其作探针就可以从cDNA库或基因组库筛选全长的cDNA或基因组克隆。理论计算用24～26种5′端10-mer随机引物，与每一个3′端引物配对，经288次或312次PCR反应，几乎可以覆盖所有的mRNA^［2，8］。

完整的DDPCR由3个基本步骤和2个附加部分组成^［6，9］：(1)反转录(RT)：将mRNA反转录成cDNA；(2)PCR：扩增cDNA；(3)测序胶电泳显示差异片段；(4)差异片段再扩增克隆；(5)确证差异并测序：Northern Blot及序列分析。其优点：(1)简单、快速，能短时间内同时比较几种组织和细胞的基因表达，找到与疾病或信号刺激相关的基因，甚至是新基因；(2)灵敏，扩增细胞中的所有mRNA只需不超过5 μg的总RNA^［6］；(3)重复性好，如果一条差异带能重复一次，则90%能多次被重复^［8］；(4)可同时检测上调和下调基因；(5)可同时检测只出现于健康组织中的基因(如肿瘤抑制基因)和只存在肿瘤中的基因(如肿瘤标记物、激活的致癌基因等)。

三、DDPCR在神经系统疾病研究中的应用

1．脑缺血：为深入理解脑缺血的分子机制，Wang等^［10］用大脑中动脉阻塞法(MCAO)建立大鼠局部脑缺血模型，提取缺血侧和对侧未缺血皮质中mRNA，经DDPCR找到1个与脑缺血相关的新基因，其编码1个新近发现的肽-肾上腺髓质素(adrenomedullin, AM)。MCAO 3小时后，AM mRNA表达明显升高(17.4倍)，6小时后升高21.7倍，且持续升高至第15天。免疫组化定位AM在缺血的神经中，放免法显示AM与脑皮质中的降钙素基因相关肽受体有高度亲和性。对AM功能研究发现其有扩血管作用，脑室内注射AM能增加脑损伤的程度，提示其在局部缺血性脑损伤过程中起作用。

2．脑肿瘤：脑胶质瘤形成的分子机制相当复杂，包括染色体异常、癌前基因激活、肿瘤抑制基因失活和生长因子及其受体表达异常等。因肿瘤抑制基因存在于正常脑组织中，故探寻工作比较困难。近年Uchnyama等^［11］用DDPCR法成功地寻找到一个与脑胶质瘤相关的基因，其序列代表动力蛋白重链(kinesin heavy chain, KHC)。他们分别从正常脑组织、未成形的星形细胞瘤和胶质瘤中提取RNA，然后进行mRNA差异显示，经Northern Blot证实KHC只在脑组织中表达。该研究说明DDPCR为我们提供了一个寻找脑肿瘤致癌基因、肿瘤抑制基因和肿瘤特异性标识物的新方法，在缺乏基因序列及其他背景资料的前提下，可用该方法同时比较多种组织和细胞mRNA的表达。

3.神经损伤及再生：神经再生是一个相当复杂的过程，与生长因子、肽类和细胞骨架蛋白的上调等有关。轴突切断的分子机制目前尚不清楚，对神经损伤后再生的过程也知之较少。Kiryu等^［12］切断大鼠一侧舌下神经，7天后分离手术侧和对侧正常的舌下神经核，通过DDPCR发现一个编码谷氨酰胺转运体(glutamate transportor)的基因。原位杂交显示该转运体主要存在于神经元中。谷氨酰胺是神经系统中的一种主要的兴奋性神经递质，具有神经毒作用，正常情况下，由突触前神经末梢快速摄取而终止其毒性作用，在某些神经变性病，脑外谷氨酰胺增多，可能与神经末梢摄取异常有关。本实验切断轴突运动神经后第4～11天，谷氨酰胺转运体表达增加，可能是减少局部谷氨酰胺的浓度从而维持神经元的生存，并增加神经元对再生过程中集聚的谷氨酰胺的抵抗能力。

4．强直性肌营养不良(DM)：DM是一种常染色体显性遗传性疾病，临床表现为肌强直、肌萎缩、肌无力及心脏传导阻滞等。病情的严重程度与DM激酶(DM kinase, DMK功能不明的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶）基因3′端非翻译区内一个不稳定的三核苷酸CTG重复扩增有关，且在遗传上呈早发现象。为明确DMK在DM发病过程中的作用，Bush等^［13］选用BC3H1肌细胞系，用DDPCR分析其基因表达，结果发现转染DMK的细胞有6条差异带，经测序和Northern Blot确证，有5种mRNA表达: 生肌蛋白(myogenin)，视网膜母细胞瘤抑制基因，M肌酸激酶，β-原肌球蛋白(β-tropmyosin) 和波形蛋白(vimentin)。表达DMK的细胞新基因的表达方式与分化的BC3H1细胞完全相同，推测DMK可能通过作用于肌源(myogenic)性基因产物而影响肌肉的发育。

综上所述，DDPCR是一种能全面检测组织或细胞基因表达的方法。虽然存在一定的缺点和局限性，如假阳性率高、筛选到的基因特异性不高等。但随着该技术发展和应用，对多种神经系统疾病的研究一定会取得很大进展。

作者单位：200040 上海医科大学神经病学研究所

参考文献

1Liang P, Pardee AB. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992, 257: 967-971.

2Bauer D, Muller H, Reich J, et al. Identification of differently expressed mRNA species by an improved display technique ( DDRT-PCR). Nucleic Acids Res, 1993, 21: 4272-4278.

3Liang Y, Averboukh L, Keyomarsi K, et al. Differential display and cloning of Messenger RNAs from human breast cancer versus mammary epithelial cells. Caner Res, 1992, 52: 6966-6968.

4Nishio Y, Aiello LP, King GL, et al. Glucose induce genes in bovine aortic smooth muscle cells identified by mRNA differential display. FASEB J, 1994, 8: 103-106.

5Utans U, Liang P, Wyner LR, et al. Chronic cardiac rejection: identification of five upregulated genes in transplanted hearts by differential mRNA display. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 6463-6467.

6Liversey FJ, Hunt Sp. Identifying changes in genes expression in the nervous system: mRNA differential display. Trends Neurosci, 1996, 19: 84-88.

7Jackson RJ, Standart. Do the poly(A) tails and 3' untranslated region control mRNA translation？ Cell, 1990, 62: 15-24.

8Bauer D, Warthoe P, Rohde M, et al. Detection and differential display of expression genes by DDRT-PCR. PCR Methods Appli, 1994, 4: S97-108.

9Liang P, Pardee AB. Recent advances in differential display. Curr Opin Immunol, 1995, 7: 274-280.

10Wang XK, Yue TL, Barone FC, et al. Discovery of adrenomedulilion in rat ischemic cortex and evidence for its role in ex