中华血液学杂志CHINESE JOURNAL OF HEMATOLOGY

1999年第20卷第11期vol.20No.11 1999

赵明峰陈桂彬邵宗鸿

关键词：阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH） pIG-A基因 GPI锚连蛋白

阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）是一种获得性克隆性造血干细胞疾病，临床表现多样，以持续性血管内溶血，阵发性加重为主要特征。业已证明，PIG-A基因突变而导致糖化磷脂酰肌醇（GPI）合成障碍，致使血细胞GPI锚连蛋白缺失，是引起PNH溶血等临床表现的主要原因。PIG-A基因突变及其引起GPI锚连蛋白的缺失在PNH发病、诊断及治疗方面的作用已越来越受到重视。

1PIG-A基因的概况PIG-A基因位于染色体Xp22.1上，全长约17 kb，编码含484个氨基酸的蛋白产物。编码区由1 452 bp组成，共有6个外显子，其中外显子1含5′非翻译区的一部分，外显子2含5′非翻译区的剩余部分和大约一半的编码区，3′非翻译区位于第6外显子的3′端（约2.1 kb），外显子1至其上游583 bp之间为启动子区，其中有4个CAAT盒，2个AP-2序列，以及1个顺式调控元件。这些序列对PIG-A基因的表达非常重要^［1］。PIG-A基因参与了GPI生物合成的第一步：GlcNAc-PI(N-乙酰葡糖胺-磷脂酰肌醇)和GlcN-PI(N-葡糖胺-磷脂酰肌醇)的合成。GPI是在内质网中合成的。首先是GlcNAc(N-乙酰葡糖胺)从UDP-GlcNAc转移至PI，生成GlcNAc-PI，脱乙酰基后生成GlcN-PI，再加甘露糖，然后再加磷酸乙醇胺，最后经过修饰而成。在整个合成过程中至少有10个基因参与，其中第一步还有另外2个基因PIG-C、PIG-H，其它步骤中有PIG-B、PIG-G、PIG-F等^［2］。

突变的细胞杂交实验可使GPI缺陷得到纠正，证明单一的PIG-A基因突变即可引起PNH表型^［3］。目前的研究表明，在所有已检测的PNH患者血细胞中，都发现有PIG-A基因突变而导致GPI锚连蛋白的部分或全部缺失，说明PIG-A基因突变在PNH发病中有重要作用^［4］。实际上，参与GPI合成的基因很多，包括PIG-B、PIG-C、PIG-F、PIG-H等，但它们均位于常染色体上，一次突变不足以引起PNH表型。PIG-A基因位于X染色体上，由于人类在胚胎发育中，两条X染色体的一条发生了随机灭活，故PIG-A基因一次突变即可导致PNH表型，这也可能是检测到PNH突变基因均为PIG-A的原因^［5］。

2PNH中PIG-A基因突变的情况PNH的PIG-A基因突变为异质性的，突变位点各不相同。Nafa等^［6］总结了20篇报道中105例PNH患者的总共123种PIG-A基因突变的情况。在这105例患者中，46例有典型的溶血症状，29例为再生障碍性贫血-PNH（AA-PNH）综合征，30例未分类。在123种突变中，112种只被检测到1次，11种多次被检测到。报道了3种突变有大的缺失，其中1例整个PIG-A基因缺失；1例有包括外显子3，4，5共4 kb的缺失；1例缺失了737 kb，包括一部分启动子，整个外显子1和部分内含子1。70种突变导致移码（45种为小的缺失，16种为小的插入，6种为缺失/替换，3种为插入/重复）。14种无义突变。12种突变破坏了拼接位点（10种为核苷酸的替换，1种为单一核苷酸的缺失，1种为1，2核苷酸的缺失）。因此，总共99种突变可导致PIG-A蛋白功能的全部丧失。另外24种突变（22种为错义突变，2种为框架缺失的突变）可导致PIG-A蛋白功能的部分或全部丧失。在所有突变中，移码突变占大部分。在欧洲人中发现了一种遗传性的第2外显子单一核苷酸的替换（C 55→T），其发生率约为6%。有典型溶血症状的PNH和AA-PNH综合征相比，PIG-A基因的突变谱无明显不同。作者还注意到虽然PIG-A基因突变可发生于编码区的任何部分，但错义突变发生于第2外显子较发生于其它外显子的比例高。然而，整个PIG-A基因并没有“热点”突变区域。

根据GPI锚连蛋白在血细胞上的表达不同，可将PNH患者的血细胞分为三种：PNHⅠ型细胞（GPI锚连蛋白表达正常），PNHⅡ型细胞（GPI锚连蛋白部分缺失），PNHⅢ型细胞（GPI锚连蛋白完全缺失）。有研究表明，PNHⅡ型细胞也可检测到PIG-A基因的突变，但其突变多为点突变，因而推测这些点突变可能导致PIG-A蛋白的活性部分丧失而产生PNHⅡ型细胞^［7］。另外，发现在PNHⅢ型细胞中，PIG-A基因的无效突变较PNHⅡ型细胞为多^［6］。

Kawaguchi等^［8］分析了40例PNH患者外周血细胞中CD₅₅、CD₅₉的表达情况，发现27例（67%）患者PNHⅡ型和Ⅲ型细胞共存，提示这些患者有一种以上的PIG-A基因突变，且可能有多个PNH克隆。而Nishimura等^［9］统计了直接检测PIG-A基因的结果表明，同时有多个不同的PIG-A基因突变的PNH患者的比例约为20%，而且通常只有一种克隆占优势。

值得指出的是，PIG-A蛋白仅作为催化剂参与GPI的合成，故PIG-A蛋白仅有部分活性就可产生大量的GPI，因此，许多PIG-A基因的错义突变并不能产生PNH表型^［10］。

Norris等^［11］初步研究了PIG-A基因突变位点的不同对PIG-A蛋白结构和功能的影响。作者分析了18例PNH患者PIG-A基因的错义突变，发现有6例位于编码子128～129和151～156上，这些编码子位于小鼠和酵母PIG-A同源基因的高度保守的区域内，因此，猜想这些编码子可能编码PIG-A蛋白的关键部分。作者用点诱变的方法，获得具有这些编码子突变的PIG-A的cDNA，分别转入原核及真核表达系统，测其PIG-A蛋白的结构及功能。结果表明，编码组氨酸128（H 128）、丝氨酸129（S 129）和丝氨酸155（S 155）的编码子发生错义突变可导致PIG-A蛋白功能的部分丧失，而发生于编码侧链氨基酸残基的编码子的错义突变对PIG-A蛋白功能无影响。提示编码H 128、S 129和S 155的编码子是影响PIG-A蛋白功能的关键部分。

3PIG-A基因突变与GPI锚连蛋白在PNH血细胞中的表达GPI锚连蛋白有很多种，但CD₅₅、CD₅₉存在于所有系列的血细胞中，且与临床表现密切相关，故将这两种蛋白作为PNH克隆的标记。PNH为一种克隆性造血干细胞疾病，自多能干细胞至各系成熟血细胞都有GPI锚连蛋白缺失，但各系列受累及的程度不同。

Terstappen等^［12］的检测结果表明，PNH患者骨髓中的造血干细胞（CD₃₄⁺CD₃₈^-）主要为CD₅₅^-、CD₅₉^-，但也有一小部分为CD₅₅⁺、CD₅₉⁺的正常细胞。两群不同的细胞各自分化成熟，致外周血中的各系血细胞也主要分为两群。在PNH缓解后，骨髓中PNH表型的造血细胞被正常的造血细胞所取代。有的研究表明，虽然PNH患者骨髓中的CD₃₄⁺细胞大部分为PNH表型的细胞，但外周血中的CD₃₄⁺细胞仍是正常的，经过粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员后，动员出的多为正常的造血干细胞。认为这为PNH患者行自体外周血干细胞移植提供了思路^{［13，14］}。但最近的一项研究表明，虽然PNH患者的外周血造血干细胞PNH表型是正常的，但经G-CSF动员出来的主要为具有PNH表型的造血干细胞^［15］。

Navenot等^［16］检测了16例PNH患者外周血中红细胞、粒细胞、血小板、单核细胞的CD₅₅、CD₅₉的表达。发现所有系列的血细胞均有两种蛋白表达不同程度的缺失，每个患者缺失程度不一。但是，红细胞缺失程度显然要较粒细胞、血小板为低。Pakdeesuwan等^［17］分析了9例PNH患者PIG-A基因突变与GPI锚连蛋白表达之间的关系，发现9例患者均有PIG-A基因突变，61.5%为移码突变。所有患者均有50%～100%的粒细胞完全缺失CD₅₅，而4例患者的红细胞的CD₅₅、CD₅₉表达完全缺失、部分缺失和正常的三群细胞共存。以上结果提示PNH患者都有PIG-A基因突变，但红系GPI锚连蛋白缺失程度少于粒系，其原因可能有：①红细胞寿命长，随时间推移具有PNH表型的红细胞被破坏，致使其比例减低；②具有PNH表型的红细胞较其它血细胞更易受到补体的破坏而溶血；③经常输注正常人的红细胞。由此可见，PNH患者外周血中中性粒细胞更能反映骨髓中PNH克隆的情况。Rabesandratana等^［18］研究发现，在网织红细胞分化为成熟红细胞过程中，其释放的囊泡中含有大量的GPI锚。此结果解释了PNH患者成熟红细胞GPI锚连蛋白表达少于网织红细胞的原因。

淋巴细胞的GPI锚连蛋白缺陷较其它系列要轻，其PNH克隆的出现较其它系列晚，但在外周血中维持的时间较长。甚至在PNH缓解后，外周血中粒、红细胞的PNH克隆消失后，淋巴细胞的PNH克隆仍可维持很多年^［19］。最近，Richards等^［20］进一步分析了19例PNH患者（18例活动性的，1例自发缓解）淋巴细胞亚群GPI锚连蛋白的表达情况，发现所有患者都有淋巴细胞亚群异常，较常见的异常为NK细胞、B淋巴细胞绝对数低于正常对照。具有GPI锚连蛋白缺失的B、T淋巴细胞及NK细胞的患者分别占所有患者的88%、84%和89%。大部分患者NK细胞GPI锚连蛋白缺陷细胞的比例高于B或T淋巴细胞。所有病例并无并发严重感染的情况。作者认为，T、B淋巴细胞由于经历了无效生成及阴性选择，使其GPI锚连蛋白缺陷细胞比例较低。PNH患者中淋巴细胞亚群的异常同体液免疫及感染的关系尚待进一步研究。

4PIG-A基因突变与PNH克隆增殖优势PNH克隆作为一种有缺陷的克隆（PIG-A基因突变，GPI锚连蛋白缺失），却能在PNH患者的造血生成中占据优势——有缺陷<