中华儿科杂志

CHINESE JOURNAL OF PEDIATRICS

1999年第37卷第9期Vol.37No.9 1999

李惠芳于载泺

关键词：免疫球蛋白重链（IgH） T细胞受体（TCRs） 基因 白血病微小残留病(MRD）

近年来应用免疫球蛋白重链（IgH）和（或）T细胞受体（TCRs）基因重排作为急性白血病细胞特异性标记，并作为白血病微小残留病（minimal residual disease, MRD）的检测指标已有不少报道。应用分子杂交、PCR等方法检测急性淋巴细胞白血病的IgH和（或）TCRs基因重排，其阳性率分别为80%～95%和50%～70%^［1，2］。但是在未检出IgH和（或）TCRs基因重排的病例以及MRD检测阴性的病例中，由于种种原因出现了假阴性，其中IgH和（或）TCRs基因重排时寡克隆的形成及克隆演化是重要原因之一，在儿童急性白血病中大约占30%～50%^［3-5］。

（一）IgH和TCRs基因重排时寡克隆及克隆演化发生的机制：正常造血细胞向B或T淋巴系定向转化时，在重排信号的启动下发生特异性Ig和TCRs基因的重新组合，在结构上使分散排列在DNA上的V、D、J基因片段发生重排，形成了免疫球蛋白和T细胞受体的功能性基因。最初采用常规PCR或分子杂交等检测白血病细胞的IgH和TCRs基因重排时，多数表现为单一的扩增条带和特异的杂交带型，因而认为白血病细胞为单克隆起源，认为同一病例的所有细胞中V、D、J片段，V-D和D-J间的N序列均完全相同。随着研究的深入，发现了部分白血病细胞的IgH和（或）TCRs基因重排表现为寡克隆，即在同一病例出现了具有二种或二种以上重排方式的细胞，随着疾病的进展其重排方式还会发生变化，即克隆演化。就IgH为例，序列分析结果进一步证实寡克隆形成的二种机制：（1）V-V片段置换。IgH基因在发生第一次完全重排后仍保留发生第二次重排的能力。当体内重组酶活性增高时即可通过V-V的置换，在已形成的V-D-J重排的基础上而再次重排，此时的N区序列具有同源性^［6］。有研究表明重排激活基因(recombination activating genes 1 and 2,RAG1 and RAG2)的表达已足以启动细胞中IgH和TCRs基因的重排。而在儿童B-ALL中已有报道具有重排激活基因的表达^［7，8］。（2）V_H-DJ_H前体重排。不同亚克隆利用不同V_H片段与DJ_H前体发生重排。此种情况发生于白血病细胞的不完全性IgH基因重排而产生DJ_H前体的病例中，此时的N区序列不具有同源性。一般而言，同一病例只会有一种机制导致寡克隆形成^［6］。除此之外，寡克隆形成的其它原因包括基因突变、缺失以及在基因重排过程中每一次V-D-J的结合所伴有的非模板性核苷酸序列的插入，而且随机插入的核苷酸的数量从1～20个不等。

克隆演化是在MRD检测中对IgH和（或）TCRs基因重排方式以及寡克隆形成的长期动态观察的结果。在白血病的治疗过程中，其细胞的IgH和（或）TCRs基因可以是在原有重排方式的基础上又出现了另外一个或多个新的重排方式；或者原有重排方式完全消失，而出现了新的重排方式；或者是寡克隆数量的改变；或者是在白血病初发时MRD检测为阴性，随着疾病的发展而出现了单克隆或寡克隆形式的基因重排。广义的克隆演化还包括那些在疾病进展过程中，免疫球蛋白重链、轻链和T细胞受体δ、γ、β、α之间的基因重排方式的变化。有文献报道在白血病初诊时的那些非主要重排克隆，在复发时变为主要克隆，推测寡克隆或克隆演化的形成可能是在细胞发生转化时就已存在多种不同的克隆细胞群，由于增殖优势而导致克隆演化。增殖优势可能还是化疗后的抗药性克隆在持续药物治疗后筛选的结果。这种优势产生于新克隆中的细胞及分子水平的某些改变^［5］。

（二）IgH和TCRs基因重排寡克隆和克隆演化检测的意义：在以IgH和（或）TCRs基因重排作为MRD检测指标的研究中，寡克隆和克隆演化已经越来越受到重视。Steenbergen等^［9］在检测一组儿童B-ALL的IgH基因重排时，应用分子杂交方法，结果为寡克隆约56%（10/18例），用IgH的一系列V、D家族的特异性引物扩增重排序列时，结果表现为寡克隆约78%（14/18例），这其中的4例应用Southern Blot杂交方法检测结果表现为单克隆。在多数文献报道中，包括双等位基因重排的寡克隆发生率大约在30%～50%，还有报道达67%^［4，10］。TCRs基因可能由于其基因重排位点对重组酶易感性较低，转化了的肿瘤细胞及其子代细胞已经有了较成熟固定的TCRs基因重排，因而与IgH基因相比较稳定。但是无论在B-ALL还是T-ALL均存在寡克隆和克隆演化，一般在20%左右^［4，11］。Marshall等^［4］为了观察儿童急性淋巴细胞白血病中IgH/TCRs基因重排的克隆演化，对初诊时具有IgH/TCRs基因重排的病例进行追踪观察，发现IgH双等位基因重排为15%（5/33例），寡克隆为18%（6/33例）。15例TCRγ基因重排全部为单克隆。在第一次复发时分别有27%（9/33例）和7%（1/15例）发生IgH和TCRγ基因重排的克隆演化，表现为5例在复发时完全出现了新的重排类型或完全失去了原有的重排类型；4例为PCR扩增带的部分丢失和新的扩增带的出现。追踪结果显示，在所有于第一次复发后又获得完全缓解的病例中约50%的病例有克隆演化，发生克隆演化者多数表现有寡克隆，而发生变化的则多数是那些非主要重排克隆，随疾病进展而成为主要重排克隆，从而提示在发现白血病有寡克隆形成时，更有必要对其进行追踪观察。不注意这些问题，临床MRD观察中常可出现假阴性的结果。有文献报道在临床白血病复发前的3～18个月既可表现为分子水平的改变，推测有一部分发生克隆演化的白血病患者是由于药物筛选的结果，使抗药的克隆在化疗后成为主要克隆。

近年来虽然对MRD检测中寡克隆和克隆演化的形成有一些报道，长期动态检测和大量病例的总结，有益于提高其在MRD检测中的临床意义。

（三）IgH和TCRs基因重排寡克隆和克隆演化检测方法的探讨：随着分子生物学技术的广泛应用，分子杂交和PCR等方法不仅使IgH和TCRs基因重排检测的敏感性提高至10^-3～10^-6，还可用于寡克隆和克隆演化的检测。就PCR方法而言，提高检出率的关键是引物的设计。虽然IgH和TCRs基因的V、D、J数量多、变化大，但是它们存在一些保守序列。另外多数白血病细胞的IgH基因重排最常使用的V基因是V₃，其次是V₄和V₆；最常使用的J基因则是J₅和J₆^［12］。在IgH的6个V区中，V_H引物取自其近3′末端6个V_H基因中同源的保守序列。J_H引物则取于6个J区在3′末端的同源保守序列。如此设计对白血病骨髓标本的检测阳性率大约为70%～90%。但是假阴性的发生率仍在20%左右。近年又通过多种改良的PCR和分子杂交方法检测IgH和TCRs基因重排，如巢式PCR（nested PCR）或半巢式PCR（semi-nested PCR）、液相分子杂交、PCR产物限制性内切酶图谱分析及异源双链形成实验等，均在不同程度上提高了MRD检测的敏感性^［13-15］。但有些实验操作繁琐，对寡克隆的形成并非特异性。

分子杂交和PCR方法检测寡克隆形成时，有可能出现以下二种情况。（1）变化的序列不影响探针与DNA的互补或不是发生在PCR引物的结合部位，分子杂交结果会出现超过相应的每个细胞染色体数以及在杂交带的密度上有很大不同的限制性片段长度多态性，或者PCR结果表现为二条或超过二条以上的PCR扩增带的寡克隆形式。这种情况也包括了来自父母双方的二个等位基因的重排；（2）寡克隆和克隆演化的发生部位正是探针或PCR引物的结合部位。为了能够检测到这种改变，通常是采用一组PCR特异引物。一方面减少了由于基因重排所用的不同V、D、J基因而造成的假阴性，还可作为进一步追踪检测时分子杂交特异性探针。由V-V片段置换和V_H-DJ_H前体重排所形成的寡克隆在ALL中的发生机率几乎相等。并且在这二种形成机制中，D-J序列不被累及。因此应用特异性PCR引物扩增D-J区，作为分子杂交的探针，使克隆演化所致的假阴性减少约10%^{［10，16］}。

进一步对PCR扩增产物进行序列测定可以精确检测到基因重排过程中伴有的DNA片段的插入、缺失及基因突变等改变。但是DNA序列测定较为复杂，仅适用于实验研究，而难适用于临床常规检测。

对PCR产物进行单链构相多态分析，(single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products, PCR-SSCP),其基本原理为等长的DNA单链因其碱基顺序的不同，甚至单个碱基的不同，就会形成不同的构相。通过中性聚丙酰胺凝胶电泳而表现不同的迁移率，因而此方法较为敏感。在一部分PCR电泳表现为单克隆的情况下，经PCR-SSCP分析则出现超过三条以上的单链构相，表明为寡克隆的存在。可特异性的检测，由于DNA序列的不同包括N区的插入、碱基的缺失、基因突变等原因所致的寡克隆形成和克隆演化。SSCP的检测方法是建立在PCR的基础上，方法简单，易于操作，敏感性较高，无须使用同位素，不仅适用于实验研究，而且可用作临床检测。

目前关于白血病IgH和TCRs基因重排中寡克隆和克隆演化的研究结果显示，其变化的多样性是导致检出率难以提高的主要因素。因而，寻找其变化的规律及在临床预后中的意义应是研究的重点之一。

作者单位：100034北京医科大学第一医院儿科

参考文献

1Yamada M, Hudson S, Tournay O, et al. Detect