中华血液学杂志CHINESE JOURNAL OF HEMATOLOGY

1999年第20卷第11期vol.20No.11 1999

李梁裴雪涛

关键词：CD₃₄^-Lin^-细胞 造血干细胞（HSC） 移植 造血

造血干细胞（HSC）凭借其强大的自我更新和多系分化的能力而维持机体造血处于一相对恒定的状态，并持续一生。因此，HSC被认为是进行造血组织移植后重建长期造血和免疫功能的关键成分，而且在某些疾病的基因治疗中是最理想的靶细胞。因而，如何有效地分离纯化造血干细胞始终是血液学研究领域的热点问题，这使得造血干细胞表型的研究显得尤为重要。目前，普遍认为人HSC的表型为CD₃₄⁺CD₃₈^-Lin^-HLA-DR^-Thy-1⁺c-kit⁺LFA-1^-CD_45RA^-CD₇₁^-Rho^dull。其中CD₃₄是早期造血细胞表面的一个重要分子，且随着细胞的分化成熟而表达下调甚至消失。目前临床和实验室分离HSC的方法均是针对CD₃₄分子来进行的。然而，近两年来对于HSC的体内和体外研究表明，一些能够重建长期造血和免疫功能的干细胞除了缺少系特异性标志外，也不表达CD₃₄分子。那么，这些CD₃₄^-Lin^-细胞是否为比CD₃₄⁺细胞更原始的前体细胞呢？下面仅就CD₃₄^-Lin^-造血细胞生物学特性的研究进展作一综述。

1造血干细胞的检测方法体内长期骨髓再植测试（marrow repopulating assay，MRA）仍然是目前检测造血干细胞自我更新和多向分化能力的主要方法和指标。对于人的HSC则在很大程度上依赖集落培养及长期液体培养等体外测试来间接反映。近年来发展了数种动物模型，使得在动物体内对人造血细胞的长期造血重建能力进行评价成为可能。在这些动物模型中，最为可靠的是绵羊子宫内胎羊移植系统^［1］。该系统是在胎羊免疫系统发育前于子宫内将人的造血细胞移植入绵羊的胚胎，在胎羊出生后通过追踪体内人造血细胞以及不同系的分布来判断移植的人造血细胞是否具有长期重建多系造血的能力。这一系统不仅能进行长期观察（达数年），而且可以进行次级受者移植研究。除人/羊异种模型外，另一模型是由Dick等^［2，3］发展的重症联合免疫缺陷(SCID)或NOD/SCID小鼠移植检测法。同子宫内胎羊移植系统相比，SCID小鼠移植在操作上要容易得多，但它对于检测人造血干细胞活性也存在局限性，例如,因这些小鼠在12个月内死亡而使得长期观察以及次级移植实验等有一定的难度。另外，在NOD/SCID小鼠体内人造血细胞向淋巴系的分化也受到影响。由于这些限制，所以确切地讲这种细胞应被称为SCID小鼠再植细胞（SRC，SCID repopulating cell）而不能完全等同于造血干细胞。基于这些测试方法，许多研究都发现具有长期造血重建能力的造血细胞均为CD₃₄⁺Lin^-，但近年来在CD₃₄^-细胞群中也发现了具有重建长期造血能力的细胞。

2CD₃₄^-Lin^-细胞群中含有造血干细胞的证据Osawa等^［4］将曾被证明含有原始HSC的小鼠骨髓c-kit⁺Sca-1⁺Lin^-细胞群分为CD₃₄⁺、CD₃₄^lo/-和CD₃₄^-三个细胞亚群，并分别输注给经致死剂量照射的小鼠。虽然100个未分群的c-kit⁺Sca-1⁺Lin^-细胞便足以起到保护作用，但单纯300个CD₃₄^lo/- c-kit⁺Sca-1⁺Lin^-或CD₃₄⁺ c-kit⁺Sca-1⁺Lin^-亚群的细胞都表现出很差的辐射保护能力，而当两者共同输注时，却可观察到短期和长期造血的恢复，提示这两群细胞可能分别为定向的祖细胞（快速短期的植入）和造血干细胞（延迟但持久的植入），它们对于动物辐射后的保护都是必不可少的。为了进一步证实这个假设，他们利用C 57BL/6背景但Ly 5抗原等位基因不同的两种小鼠对这三群细胞分别进行竞争性长期重建（competitive long-term reconstitution，CLTR）分析。研究结果显示，CD₃₄⁺c-kit⁺Sca-1⁺Lin^-亚群的细胞表现出早期但并不持久的多系造血重建，说明这一群细胞虽能够向多系分化但已失去自我更新的能力，因而并不符合HSC的特点。相反，CD₃₄^lo/-c-kit⁺Sca-1⁺Lin^-细胞移植后却表现为延迟而持久的多系重建。进一步的实验则用供者的单个CD₃₄^lo/-c-kit⁺Sca-1⁺Lin^-细胞对经致死剂量辐照后的受者小鼠进行移植，在21％的受者小鼠中观察到了多系的造血重建达3个月以上，而且在存活小鼠的外周血中大约85％的淋巴系和髓系细胞均为供者来源，同时在受者的骨髓中还检测到供者来源的CD₃₄^lo/-和CD₃₄⁺细胞，从而提示CD₃₄^lo/-细胞在体内得到扩增并可向CD₃₄⁺细胞分化。次级受者移植表明，初级受者小鼠体内供者来源的CD₃₄^lo/-c-kit⁺Sca-1⁺Lin^-细胞再次移植后仍能重建受者小鼠的造血达4个月。这些结果均表明小鼠骨髓中CD₃₄^-Lin^-造血细胞具备HSC的自我更新和多系分化的特点。Jones等^［5］研究发现，所分选的Lin^-和高表达醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）造血细胞属于CD₃₄^lo/-亚群，且10个Lin^-ALDH⁺骨髓细胞便可重建致死剂量辐射受者小鼠的各系造血达15个月，而在进行次级受者移植后8个月时外周血中仍可检测到供者来源的细胞。Morel等^［6］也发现，将小鼠骨髓Thy-1^loLin^-/loSca-1⁺（TLS）细胞群中的CD₃₄⁺和CD₃₄^-细胞分别移植给致死剂量辐射的小鼠后，CD₃₄^- TLS的受者小鼠造血恢复略迟于CD₃₄⁺ TLS的受者小鼠，同时竞争性再植单位（competitive repopulating unit，CRU）的检测发现其在CD₃₄⁺ TLS中频率为1/132，而在CD₃₄^- TLS中则为1/37，提示在CD₃₄⁺ TLS细胞群中富含中短期多系祖细胞，而在CD₃₄^- TLS细胞群中则缺少祖细胞而高度富集了具有长期重建潜能的HSC。另外，Goodell等^［7］基于荧光Hoechst染料的迅速泵出而从小鼠骨髓中筛选鉴定了一类特殊的细胞群（side population，SP），它们具有长期骨髓重建活性，同时更为重要的是它们均无CD₃₄的表达^［8］。

动物研究如此，那么人的HSC是否也为CD₃₄阴性呢？利用前面所述的两种动物模型，Zanjani^［9］和Bhatia等^［10］分别利用胎羊和NOD/SCID小鼠模型对人的CD₃₄^-Lin^-细胞中HSC的活性进行了鉴定。他们将分选出的CD₃₄⁺Lin^-、CD₃₄⁺Lin^-CD₃₈^-和CD₃₄^-Lin^-细胞群进行了初级和次级胎羊移植的研究。结果发现，当移植3.5×10⁶个CD₃₄^-Lin^-细胞时，所有4只初级受者绵羊均为嵌合型，在每只受者体内都可检测到多系的人造血细胞，包括髓系（CD₃₃⁺）、红系（glyA）和淋巴系（CD₃⁺）细胞，同时还可检测到CFU-GM和CFU-Mix祖细胞，在移植后达10个月以上时存活的受者绵羊骨髓中仍存在人的造血细胞，表明植入了具有长期造血重建能力的HSC。更为有趣的是，在移植后60天时这些初级受者动物体内均可观察到大约10⁹个CD₃₄⁺造血细胞，这几乎是在移植CD₃₄⁺细胞受者体内所检测到的CD₃₄⁺细胞的2倍，这也支持CD₃₄^-Lin^-细胞是CD₃₄⁺细胞前体的假设，同时说明了在受者体内CD₃₄^-细胞的大量扩增。由于有研究证明，在初级受者体内人造血细胞活性的长期存在也可能是来自定向的人造血祖细胞^{［11，12］}，故为了确证CD₃₄^- Lin^-细胞的长期植入活性，Zanjani等又进行了次级受者移植研究。在移植后60天时，来自移植有CD₃₄⁺细胞初级受者骨髓的CD₄₅⁺细胞移植给6只次级受者胎羊，其中5只为嵌合型，而移植来自CD₃₄^-细胞初级受者骨髓CD₄₅⁺细胞的6只次级受者胎羊则全部为嵌合型，且均为多系植入。这种能够植入次级受者的能力通常被认为是具有长期造血重建能力的干细胞。Bhatia等^［10］利用NOD/SCID小鼠模型进行的研究则证明同CD₃₄⁺Lin^-细胞一样，在CD₃₄^-Lin^-细胞群中也含有SRC，故将之分别称为CD₃₄^pos-SRC和CD₃₄^neg-SRC，但经有限稀释分析推算出在CD₃₄