国外医学遗传学分册1999年第22卷第5期

湖北医科大学附属第二医院检验科（武汉430071）

郑苏综述 周新审校

提要 低密度脂蛋白受体（LDL-R）基因突变是导致个体罹患家族性高胆固醇血症（FH）的主要病因。本文综述了LDL-R基因限制性片段长度多态性（RFLP）在FH诊断中的应用；正常人群中LDL-R基因RFLP对血清脂质水平的影响；并就LDL-R基因RFLP和其他疾病的关系作一间要介绍。

关键词 低密度脂蛋白受体；家族性高胆固醇血症；限制性片段长度多态性

家族性高胆固醇血症（FH）是一种常染色体显性遗传病，人群中杂合子频率为1/500。临床表现为血中低密度脂蛋白（LDL）胆固醇浓度的升高、腱黄瘤和早发心肌梗塞。低密度脂蛋白受体（LDL-R）基因突变是本病的主要病因。对FH病人的诊断主要是通过临床表现和家族史，但是确切的基因测试对FH的诊断会有很大帮助。特别是地于儿童，仅仅通过对胆固醇水平的估计不能得出明确诊断，这是因为FH病人和正常人之间血浆脂质有交叉重叠^[1]。另外，有些儿童血浆胆固醇水平在当时可能处于正常水平，而以后才会逐渐升高2^]。那每次这些病人的诊断就要依靠细胞生物技术与基因测试了。细胞生物技术方法太复杂，而且正常人和杂合子患者的测定结果之间有明显交叉重叠。因而基因测试的方法得到广泛应用。

LDL-R基因位于人染色体19p13.1-p13.3^[3],长45bp，由18个外显子和17个内含子组成，mRNA长5.3kb，编码含860个氨基酸的蛋白质^[4]。目前，国际上已报道了300多种不同的LDL-R的基因突变^[5]，包括缺失、插入、无义突变、错义突变。大部分突变是由于结构重排^[6]。其余是一些点突变和小的缺失或插入^[7]。

一、用RFLP直接检测LDL-R基因突变

LDL-R基因位点上碱基的突变，往往会导致酶切位点的消失或新酶切位点的产生，于是，可以用限制性片段长度多态性（RFLP）的方法直接检测LDL-R基因突变。在意大利FH病人LDL-R基因外显子7的5´末端297号位点C→T，转变导致一个新的EcoRⅠ位点的产生，可以RFLP进行检测^[8]；一个携带“Lebanese”突变的家族，由于一个碱基的替换产生HinfⅠ的酶切位点，用PCR-RFLP检测绒膜绒毛DNA，是妊娠早期诊断简单、快速的工具^[9]。还可以用RFLP检测大范围的基因变化。1997年Kerepsi等人用三种内切酶XbaⅠ、BglⅡ和PvuⅡ，对13个FH家庭（23个FH病人和36个正常人）进行RFLP分析，发现在某个病人LDL-R基因3´末端XbaⅠRFLP出现异常的4.4kb的带,被证实是一种新生突变。在两个FH家庭中的LDL-R基因5´末端发现一联合的突变，其中XbaⅠRFLP产生异常的24.5kb的带，而Ba1ⅡRFLP产生异常的17.5kb的带，显示出一个3.3kb的缺失（内含子3）和4.8kb的插入（内含子1）^[10]。

二、RFLP连锁分析诊断FH病人

使用多种限制性内切酶RFLP，确定某种单体型和致病基因的连锁相，这种RFLP连锁分析的方法在FH家族病人亲属中的诊断得到成功应用^[11，12]。在French-Canadian个体中发现LDL-R基因5´末端7kb的缺失和一种LDL-R单体型紧密连锁，于是可能用此单体型检测协助诊断FH病人^[13]。

在西斑牙，Chaves等人用HincⅡ、

avaⅡ、PvuⅡ、MspⅠ、NcoⅠ、TapⅠ、StuⅠ进行RFLP的连锁分析，在46个FH病人和61个血脂正常人中发现HincⅡ、AvaⅡ、PvuⅡ、MspⅠ和NcoⅠ是多态性最高的位点，分别含高于0.28的PCR值。在研究的大部分FH家族中，RFLP单体型相关分析进一步证实了FH临床诊断这7种RFLP联合应用可用于跟踪80%的西班牙FH病人的遗传情况^[14]。用SfaNⅠ、TaqⅠ、StuⅠ、HincⅡ、AvaⅡ、NcoⅠ的RFLP研究FH家族，发现对于HincⅡ、NcoⅠ、SfaNⅠRFLP，85%的病人至少来一种多态性杂合子，能为相关分析提供有力的信息。用这些多态性位点跟踪LDL-R基因在FH病人家族亲戚中的遗传状况，发现家族中并没有儿童继承缺陷基因。这都表明可以用FRFL相关和连锁分析配合临床诊断FH病人^[12]。

三、LDL-R基因多态性与正常人血浆胆固醇水平的关系

最近，研究发现LDL-R基因多态性会影响普通人群中的胆固醇水平。其中，研究得最多的是LDL-R内含子15PvuⅡRFLP。在英国、挪威、德国、捷克共和国、中国人群中都报道不含PvuⅡ酶切位点的P₂等位基因和低总胆固醇、低LDL胆固醇水平相联系。Gudnason还研究了冰岛正常人外显子8StuⅠ位点RFLP。发现男性个体中含StuⅠ位点的等位基因和低总胆固醇、低LDL胆固醇、低ApoB水平联系^[15]。1994年，Young等报道，美国西部西班牙和非西班牙正常白种人，对AvaⅡ和NcoⅠ基因型，总胆固醇和LDL胆固醇水平存在一种计量效应：在-/-基因型中最低，在+/+基因型中最高，-/+基因型的总胆固醇和LDL胆固醇水平介于前两者之间^[16]。当然也有LDL-R基因多态性和正常人胆固醇水平无关的。Haviland等报道LDL-R基因RFLP对血浆脂质和载脂蛋白水平影响甚微^[17]。出现这些差异，可能是由于样本例数不够大，也可能是由于所选人群不同所致。

四、LLD-R RFLP单体型分析寻找突变的来源

用TaqⅠ、BstEⅡ和NcoⅠRFLP研究三个FH家庭，在两个FH家庭中发现LDL-R基因多态性标记和疾病相关，研究数据进一步证实了基于血脂水平测试基础上的FH诊断。三种不同的单体型和疾病相关提示在这一人群中至少有三种LDL-R点突变^[18]。

在一个希腊纯合子FH病人中发现LDL-R基因408位Val→Met的突变；进而发现其父母、兄弟、祖母、叔叔、堂兄LDL-R基因都存在此突变。用6种RFLP检测这一缺陷基因的单体型，这一单体型和以前拉丁美洲和荷兰报道的不同处于希膜不同地区，这一突变可能在希膜相当普遍^[19]。

五、LDL-R基因多态性和其他疾病的关系

甲状腺机能减退的高胆固醇血症的程度和LDL-R基因多态性相关联。甲状腺激替代治疗后，血中LDL胆固醇水平的降低、TSH的减少和外显子13AvaⅡ位点RFLP显著相关。-/-基因型病人的LDL胆固醇水平降低程度是+/+基因型病人的四倍，杂合子+/-基因型病人的反应介于前者两者之间^[20]。这一研究可用于预测哪些甲状腺机能减退病人易于患冠心病。用LDL-R基因HincⅡ rFLP研究Ⅱ型糖尿病（NIDDM）人发病及其脂质代谢情况。结果发现RFLP位点多态性与NIDDM发病无关联。但LDL-R基因HinⅡ rFLP会影响糖尿病患者脂代谢的表现型。

总之，可利用RFLP直接检测FH病人基因的点突变和结构重排。并且LDL-R基因RFLP可作为基因标记构建LDL-R单体型，利用连锁分析突变的LDL-R等位基因，间接诊断FH病人，区别真正的纯合子和复合杂合子^[21]。单体型分析，即使在突变位点不能确定时，还可以用于研究突变等位基因的来源行迁移。而LDL-R基因RFLP和正常人群血清胆固醇水平及其他疾病的联系仍有待进一步研究。

参考文献

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(1998年12月14日收稿)