关键词：GBV-C/HGV株 基因型

最近研究表明^〔1，2〕，世界各地分离的GBV-C/HGV株间存在不同的基因型，即1型、2型和3型。上述分型所采用的核酸序列大多数来自非洲、欧美和日本等地，我国GBV-C/HGV分离株的基因型及其分布则报道较少。为此，本研究应用分子进化学方法对从我国5城市分离的10株GBV-C/HGV 5′-UTR部分序列进行基因分型。结果报道如下：

材料与方法

1.血清标本：HGV RNA阳性的血清标本共10份，其中BJ1和SJZ1～2分别采于北京市和石家庄市的献血员血清；BJ2 和NC1为北京市和南昌市急性乙型肝炎病人的血清; NC2，LZ1～2 分别为南昌市和柳州市慢性丙型肝炎患者血清；GZ1～2为广州市HBsAg阳性的原发性肝细胞肝癌患者血清。以上急慢性乙型和丙型肝炎按第五次全国传染病与寄生虫学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准诊断。

2．HGV RNA的检测：参见文献〔1，2〕进行。

3.PCR产物的克隆及序列测定：将纯化的目的片段连接到pGEM -T easy vector上（Promage公司产品），转化筛选后，提取质粒酶切鉴定。用T7启动子和M13反向引物分别从目的基因的两端进行自动测序（ABI prime377自动测序仪）。

4.GBV-C/HGV核酸序列的分子进化学分析：我国5城市分离的10株GBV-C/HGV 5′-UTR部分核酸序列及20株GBV-C/HGV全基因序列（用accession number表示）为本文分析的对象；核酸序列同源性比较采用Blasta程序处理；核酸分子进化树(phylogenetic tree)的建立采用进化系数（p-distance）经MEGA软件包^〔4〕处理获得，所得统计学数据bootstrap值的显著性意义以大于70%为标准。

结果和讨论

1.HGV 5′-UTR部分序列的同源性比较：参照文献〔1，2〕，设计了可覆盖5′-UTR分型区内核苷酸的引物，用RT-nPCR法进行扩增并测序，测得的我国5城市10株GBV-C/HGV cDNA的5′-UTR部分核酸序列与美国株（U44402）、西非株(U36380)、日本株(D90601)及中国株(U75356)的同源性比较，发现除部分区域的核苷酸高度变异外，大部分核酸序列相对恒定，特别是10株中国GBV-C/HGV序列间更为保守，其核酸序列同源性为93.5%～98%，而与U36380, U44402 及D90601 5′-UTR核酸序列的同源性分别为86.7%，88%和93% 。提示这一区域可用于对GBV-C/HGV 进行基因分型, 以期进一步阐明GBV-C/HGV基因结构与功能的关系；并可根据这一区域设计PCR引物，以便更有效地检测不同基因型的GBV-C/HGV变异株。

2.GBV-C/HGV 5′-UTR核酸序列的分子进化学分析：参照文献〔1，2〕，先采用20个已发表的GBV-C/HGV全基因序列，选择5′-UTR的几个不同区域用分子进化学方法进行分析。从建立的进化树和相应bootstrap值中判断，对5′-UTR的第132位至第301位核苷酸(NT₁₃₂-NT₃₀₁，核苷酸位置参照U36380为标准)进行分析发现，此区域可将上述20株GBV-C/HGV全基因序列中的已知不同基因型代表株进行恰当的分型（如图1），且与已报道的结果相符^〔1-3〕。因此，该区域中高度变异的核苷酸是目前用分子进化学方法对GBV-C/HGV进行基因分型较为理想的部位和重要依据。选用该区域对文中10株中国GBV-C/HGV的分析表明，我国5城市分离的10株GBV-C/HGV均归属于同一基因型，即3型（亚洲型）。此外还观察到：10株中国GBV-C/HGV在进化树上分布于3个不同的区域，提示此10株序列在核酸分子进化上仍有一定的距离，并形成在进化关系上更为密切的3个不同的群：A、B和 C群（如图1）；分析3个群中各变异株的情况，A群由柳州的LZ1与LZ2和广州的GZ1组成；B群由广州的GZ2，南昌的NC1与NC2，石家庄的SJZ1与SJZ2组成；而北京的BJ1和BJ2则为C群。不同变异株似乎从南到北按一定的地域性分布规律，但与其各自不同的个体来源无明显的关系。

图1中国株GBV-C/HGV 5′-UTR部分基因及部分GBV-C/HGV全基因序列的分子进化树

进化树中百分数值为bootstrap值，水平方向黑线表示GBV-C/HGV各株间的进化距离

总之，鉴于本研究分析的GBV-C/HGV核酸序列的例数所限，同时我国地域辽阔，民族众多，以及目前建立在核酸进化学上的GBV-C/HGV分型方法尚待完善和统一^〔2，3〕。因此，有关我国是否存在新的GBV-C/HGV基因型或亚型，其与生物学特性、致病性的关系有待进一步深入研究。

志谢：在分子进化学分析方面得到Dr. Donald B Smith的大力帮助。此外，朱万孚教授，朱永红副研究员对本研究给予了有益的建议与帮助，在此表示感谢。

本项目受国家自然科学基金资助（批准号：39700005）

作者单位：100083 北京医科大学微生物学系(彭宜红，庄辉，贾竹青，赵学森，戴豫)； 广西柳州卫生学校(唐荣兰)；北京医科大学第三临床医学院(钟国萍)

参考文献

1Muerhoff AS, Smith DB, Leary TP, et al. Identification of GB virus C variants by phylogenetic analysis of 5′-untranslated and coding region sequence. J Virol, 1997,716501-6508.

2Smith DB, Cuceamu N, Davidson F, et al. Discrimination of hepatitis G virus/GBV-C geographical variants by analysis of the 5′ non-coding region. J Gen Virol, 1997,781533-1542.

3王佑春，庄辉，孙彬裕，等. 我国部分地区庚型肝炎病毒5′端部分基因序列的比较. 中国公共卫生，1997，13586-587.

4Kumer S, Tamura K, Nei M, et al. MEGA: Molecular phylogenetic genetic analysis. Version 1.2,The Peunsylvania State University USA， 1993.

(收稿：1998-09-14修回：1998-12-15)