国外医学免疫学分册1999年第22卷第5期

西安医科大学免疫学教研室

史霖综述 范桂香 袁育康审阅

摘要 随着对DNA免疫学特性的深入了解，人们对CpG特征结构在DNA免疫学中的重要作用有了初步的认识，本文就CpG特征结构的特点、免疫学活性及应用前景作一综述。

关键词 cpG特征结构 CpG抑制 回文序列、细菌DNA 寡脱氧核苷酸

在对DNA结构序列中，人们发现脊椎动物DNA中存在一种称作CpG抑制的现象，即脊椎动物DNA中CpG双核苷酸出现的频率明显降低，约为细菌及无脊椎动物DNA中CpG出现频率的四分之一，且60%～90%的CpG以核苷酸胞嘧啶第五碳原子发生甲基化^[1,2]。这种脊椎动物DNA在长期进化过程中所形成的区别于细菌等其它动物DNA的结构特点有其重要的生物学意义，随着对DNA免疫学特性研究的深入，人位最终认识到CpG抑制是脊椎动物在长期进化中形成的一种识别自身和外源DNA的重要免疫机制^[3,5]。脊椎动物免疫系统正是通过对以未甲基化CpG双核苷为核心的特定核苷酸序列（CpG特征结构）的识别来辨别细菌DNA等外源性DNA，并对其产生免疫应答的。

一、DNA免疫学特性研究的发现

长期以来，DNA被认为只具有较弱的免疫原性，难以引起机体强烈的免疫反应，但自从1984年Tokunaga等发现从卡介苗（BCC）中提取的DNA片段具有抗肿瘤活性后^[6]，人们对DNA的免疫学特性开始有了全新的认识。随后Tokunaga小组根据编码BCC蛋白的cDNA合成不同的寡脱氧核苷酸（ODN），在对这些ODN免疫学特性的研究中发现：并非所有的ODN都能引起机体的免疫反应，只有那些含有一个或多个回文序列的ODN才具有免疫学活性^[7,8]。S.Yamamoto等用不同生物DNA提取免疫小鼠，发现细胞、病毒和无脊椎动物的DNA片段可以活化NK细胞，诱导IFN的产生：而脊椎动物的DNA片段则无此活性^[9]。进一步研究发现并非所有含回文序列的ODN均有活性，只有那些含有诸如AGCGCT、AACGTT和GACGTC等刺激性回文序列的ODN才能触发免疫反应^[8]。以上研究结果表明：DNA中刺激性回文序列出现的频率越高，其免疫活性越强。

随着研究的深入，人们发现所有刺激性回文序列均是以未甲基化的CpG双核苷为核心的，而在脊椎动物DNA中，对CpG的抑制也主要发生在以CpG为核心的刺激性序列上^[10]。因此得出如下结论：以未甲基化CpG双核苷为核心的特定核苷酸序列是DNA具有免疫学活性的重要条件，免疫系统通过对这些特定序列的识别来诱发针对外源性DNA的免疫应答。

二、CpG特征结构及其免疫学活性

Krieg等通过分析人工合成的不同序列ODN的免疫学活性，初步得出了活性ODN和ODN所必须具备的结构条件：①必须含有未甲基化的CpG双核苷酸，如果CpG缺失或胞嘧啶发生甲基化，则其活性丧失。②CpG两侧序列需为两个5'嘌呤和两个3'嘧啶，且当5'端为CpG，3'端为TpC或TpT时活性最强。③ODN需有一定的长度，如少于8个碱基则无刺激活性^[7,8,10]。

含有CpG特征结构的细菌DNA及活性ODN可诱发机体产生多种免疫学效应，其诱发机体免疫应答的主要过程可能为：CpG特征结构首先直接活化B细胞和巨噬细胞，诱导他们分泌IL-6、IL-12和TNF-α等细胞因子，其中IL-6进一步诱导了IgM的分泌，IL-2和TNF-α则对NK细胞和CD4⁺细胞有活化作用，诱导他们产生IFN和M活化因子（MAF），而IFN-γ又进一步促进了B细胞和M的活化。

1.对B细胞的作用 研究发现CpG特征结构具有B细胞有丝分裂原的作用，可诱导B细胞增殖活化，使之释放IL-2、IL-6及分泌IgM^[4,10]。Krieg等用经流式细胞仪纯化的B细胞体外试验，发现由活性ODN诱导的B细胞增殖和IgM产量并未发现改变，说明不需其它种类细胞的辅助，活性ODN即可诱导B细胞的增殖活化^[10]。此外还发现CpG特征结构能诱导B细胞上调对凋亡相关基因（c-myc,bcl-x_L）的表达，并下调对Fas的表达，从而保护B细胞免受细胞凋亡作用^[11-14]。

2.活化巨噬细胞 Tim Sparwasser等用B细胞、T细胞和NK细胞缺失的严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠进行实验，结果细胞DNA或活性ODN可直接活化M产生THF-α^[15,16]；用活性ODN处理体外培养的M也检测到了THF-αMRNA表达的上调^[16]，表明CpG特征结构可直接活化M产生TNF-α。

3.对T细胞的作用 首先由CpG特征结构诱生的IL-2和TNF-α可活化CD4⁺细胞，促其分泌IFN-γ和MAF。其次CpG特征结构还可诱生CTL，这可能是因B细胞的活化促进了共刺激分子（如CD86和CD25）的表达，或因CpG特征结构改变了T细胞对TCR活化信号的敏感性而造成的^[17]。

4.NK细胞的活化和IFN的诱生 CpG特征结构对NK细胞的活化作用和对IFN诱导均被认为是由IL-12和TNF-α引起的二次效应^[3,16,18]。Halpem等用细菌DNA刺激体外培养的脾细胞，发现IL-12比IFN-γ更早产生，而且当向细胞培养中分别加入抗IL-12抗体和抗TNF-α抗体后，IFN-γ的产生受到显著抑制，如将这两种中和抗体同时加入则完全抑制IFN-γ的产生^[19]，从而进一步证实了IFN为IL-12和TNF-α所诱生的观点。

虽然目前对CpG特征结构诱导机体发生免疫应答的过程有了一定的了解，但对其活化免疫细胞的机制尚不清楚，存在两种可能的机制：一是CpG特征结构和效应细胞膜表面受体结合，进而引发信号的传导；另一可能机制是活性DNA片段通过胞饮作用进入效应细胞内，其CpG特征结构模拟了效应细胞DNA上某些基因的调控序列，因此可和胞浆或核内的某些转录调控因子（如l_kB）结合，使这些调控因子失活或从NDA上解离下来，从而使原来受到调控因子抑制的基因得以活化表达^{[3,4,8,9,16,17,20,22]}。由于至今尚无发现相关膜表面受体的报道，用P³²标记的活性ODN和非活性ODN在细胞表面也未发现结合上的差异^[22]，而由脂质体包裹的活性ODN所诱导的免疫学活性显著增高^[9.21]。如将活性ODN连接在颗粒性形体载体上则其免疫活性丧失^[10]，因此目前普遍认可第二种机制。

三、CpG特征结构的应用前景

1.在DNA免疫和基因治疗中的应用 yukio Sato等在其研究中发现整合有β-半乳糖苷酶（β-Gal）的氨苄抗性（AmpR）表达质粒可以在体内诱生高水平的抗β-Gal抗体；而将整合有β-Gal的卡那霉素抗性（KanR）的表达质粒同样进行皮下注射则只产生少量的抗β-Gal抗体。进一步的研究发现AmpR基因中含有两个重复的AACGTT序列，而KanR基因则不含CpG特征结构，且如将AACGTT序列插入KanR质粒中，则其也可诱导高水平的抗β-Gal抗体^[18]。事实说明外源基因在体内的高水平表达并不一定能诱导机体产生强烈的免疫应答，CpG特征结构的存在对于诱导针对外源基因编码蛋白的免疫应答是极其重要的,由其所诱生的IL-12和IFN-γ可诱导针对质粒DNA编码蛋白的T_HI型免疫反应，并产生针对该蛋白的特异性抗体和CTL^[17,18]。虽然CpG特征结构对于DNA免疫是需要的，但其在基因治疗中却可能是有害的，因为由CpG特征结构诱生的IFN-α会直接阻碍mRNA的转录和蛋白质的合成，并能活化邻近转染细胞的巨噬细胞和T淋巴细胞，造成对转染细胞的损害^[3，18]，所以在设计用于DNA疫苗的载体时，应加入多个CpG特征结构；而在设计用于基因治疗的载体时，应尽量避免CpG特征结构的存在。

2.细菌感染诱发疾病的治疗 细菌DNA除可触发宿主的保护性免疫反应外，往往也能诱发对宿主有害的免疫病理反应。当发生严重感染时，细菌DNA能诱发TNF-α及IFN-γ等细胞因子的过量表达。其中，TNF-α可介导肝细胞的凋亡，IFN-γ可引起毒性休克^[16,20]。还证明CpG特征结构和脂多糖（LPS）存在协同作用关系，可增强LPS的毒性作用^[3,15,16,20]。另外自身性免疫疾病的发生也与细菌DNA诱导的免疫应答有关^[4，19]。因此可以研制针对CpG特征结构的拮抗剂，用于对细菌DNA诱发疾病的治疗。目前已发现抗疟疾药物盐酸阿的平（quinacrine）、氯喹（chloroquine）及他们的结构类似物对含CpG特征结构的活性ODN有拮抗作用，可望用于由细菌感染诱发的自身免疫疾病和其它相关疾病的治疗^[23]。

3.用于肿瘤治疗 由于CpG特征结构诱生的IL-12、TNF-α、IFN和CTL对肿瘤细胞均有抑制杀伤作用，所以把细菌DNA提取物或活性ODN注入瘤体内可导致免疫细胞浸润和肿瘤缩小，并已在临床肿瘤治疗中得到验证^[3,7,9]。此外有报道证明人肿瘤细胞中T_H2类细胞因子的强势表达可能与肿瘤的免疫逃逸有关^[23]，而CpG特征结构可诱导IL-12和IFN-γ的分泌，促使T_HO细胞转化成为T_H1细胞，并促其成熟，从而诱发T_H1型免疫反应，抑制T_H2型细胞因子及IgE的产生^[17,18]，起到免疫调变剂的作用。因此可望人工合成含有CpG特征结构的活性ODN，用于对肿瘤的治疗，为防止DNA酶的降解，还可采用以硫代磷为骨架的硫代ODN。

目前，对CpG特征结构的研究还处在起步阶段，尚有许多问题有待深入研究和阐明，但由其开辟的新研究领域无论在免疫学基础理论研究，还是在实际应用中都有着光明的前景。

参考文