国外医学病毒学分册1999年第6卷第1期

华西医科大学口腔医学院（成都610044）郭丽宏刘建国综述 刘天佳 贾文祥审校

[摘 要] DNA疫苗是近年比较热门的研究领域之一。不同的免疫途径接种DNA疫苗，其诱导产生免疫应答机理不同，免疫效果及其持续时间也存在差异。

DNA疫苗是近年发展的新型疫苗。DNA免疫可诱导保护性体液免疫苗对特异性CTL为标志的细胞免疫。自从1990年Wolff等人发现直接肌肉注射裸DNA质粒，不经任何特殊载体手段即可在肌细胞内取得有效的蛋白表达以来，目前已在病毒、结核杆菌、寄生虫以及肿瘤疫苗等方面进行了深入的研究，同时对DNA疫苗的接种途径和免疫效果进行了探讨。本文就DNA的免疫途径研究现状作一综述。

1 肌内注射

目前大部分研究者认为包括骨骼肌和心肌在内的横纹肌系统是最有效的摄取外源基因表达蛋白抗原的组织^[1]。肌肉组织具有安全、体积大、免疫接种容量大的优点，因此多被用来进行DNA免疫注射。

1.1 肌细胞对质粒DNA表达载体的摄取机理。质粒DNA载体进入肌组织后，在肌纤维外间质内扩散，影响扩散的主要屏障是肌束膜。灵长目动物肌组织中肌束膜较啮齿类动物厚且致密，因此灵长目动物中肌注外源性DNA的表达率较啮齿类动物低^[2]。

DNA免疫过程中肌纤维对外源质粒摄取的具体机制目前还不清楚。骨骼肌具有丰富的T小管系统和肌浆网结构，T小管中有较多的细胞外液，这些结构上的特殊性有可能使骨骼肌肌纤维直接摄取外源DNA。Davis等^[3]研究发现预先注射心肌毒素使肌纤维处于再生状态，只有当肌纤维分裂处于多核状态时，才可摄取质粒DNA，而单核的未成熟肌纤维则无摄取质粒DNA的功能，说明只有肌纤维分化形成T小管系统后，才能摄取外源DNA。肌纤维摄取DNA的过程有三种假设：①认为质粒可被处于分裂活跃状态的肌卫星细胞摄取，然后相互融合分化成新的肌细胞。但是目前来看，心肌组织和骨骼肌都能同样有效地在体内摄取外源DNA，而心肌组织中并不存在肌卫星细胞，因此可以认为肌卫星细胞介导的DNA摄取过程不是必需的。Wolff等^[4]也未在啮齿类及灵长目动物的肌卫星细胞中发生注入的β-半乳糖糖苷酶报道基因的表达；②认为注射过程中液体流的冲击作用或针头直接损伤了肌纤维的肌膜，使外源DNA沿破口进入肌浆中。骨骼肌具有多核、体积大的特点，可以修复肌膜而存活下来表达DNA产物。但多数学者不支持该种观点^[3]。因为心肌细胞虽然缺乏如肌骼肌的修复能力，但这并不影响对外源DNA的表达。同时发现对肌组织多部位针头刺扎反而减少了质粒DNA的表达。将金颗粒包被的质粒DNA、多聚赖氨酸或多聚谷氨酸三种颗粒共同转染骨骼肌，电镜下仅见结合有质粒DNA的金颗粒穿过肌纤维膜进入T小管及膜穴样内陷（caveolae）中，其它两种金颗粒均存在于肌纤维基膜外的间质中，进一步证实了肌纤维对质粒DNA的摄取不可能是通过肌膜破口^[2]；③Wolff等^[2]认为，骨骼肌在收缩过程中肌浆网中Ca⁺⁺外流进入肌浆中，致使肌纤维胞液中正电荷增加，导致带负电荷的DNA穿过基膜进入 t小管和膜穴样内陷中，这一过程不需能量介导，但存在质粒尺寸限制。他们认为质粒DNA与T小管腔膜或膜穴样内陷的包膜之间有特殊亲和力，在肌注100-500µg质粒DNA5分钟后，电镜观察显示，质粒出现在完整肌纤维的T小管系统及膜穴样内陷中。进入膜穴样内陷中的DNA通过potocytosis作用消耗能量穿过肌膜进入肌浆中。膜穴样内陷与有被凹陷不同，无笼蛋白存在，其内包含的特异受体通过GPI（glycosyl phosphatidyl inositol）锚定于膜穴样内陷的内侧包膜上，DNA进入呈开放状态的膜穴腔内后与受体结合，穴腔关闭向肌浆内迁移，腔内低pH环境便于DNA与受体分离，通过浓度梯度利用穴腔肌浆侧包膜内的载体蛋白进入肌浆中。穴腔与包含的受体再循环至肌纤维表面，呈开放状态以携带其它的DNA分子^[5]。Potocytosis仅能摄取分子量小于1000～2 000Da的小分子，而DNA的环状构型横向直径仅为2nm×4nm，可以通过potocytosis途径进入肌浆中。Wolff等^[2]指出，DNA利用的可能是其它分子的potocytosis通道，而非DNA特异性的，这种通道特异性存在于横纹肌内。Cox等^[6]发现将一定量的质粒DNA和非编码DNA（如鲑精DNA）一起肌注免疫时，当逐渐增加非编码DNA量时，质粒DNA摄取明显受到抑制，这种竞争性抑制现象提示DNA的摄取是由受体介导的。但也有学者认为，DNA的摄取是通过胞饮作用，或有被凹陷中的特异受体介导。Hagstrome等^[7]认为DNA可通过肌浆网而进入肌浆中，在肌浆网的膜结构中存在特异DNA结合蛋白，分子量为60和90KDa,可与双链DNA结合，而不与单链结合。这一假说开始受到越来越多的重视。

1.2 肌细胞对外源DNA的持续表达。Wolff等^[8]将编码β-半乳糖糖苷酶的报道基因注入小鼠后腿肌中，经组织化学染色发现，注射区约有10～30%肌纤维染成兰色，纵向染色深度可达400µm，说明肌纤维可以摄取并表达外源基因产物。用编码虫荧光素酶的质粒DNA免疫小鼠后发现，表达的酶活性呈DNA剂量依赖关系，而且报道基因可持续表达19个月之久。Wolff等进一步利用定量PCR技术，发现大多数的质粒的DNA载体可以在肌纤维内稳定持续存在，并表达；而mRNA转录产物及表达的蛋白稳定性较差，不能持续存在。作者认为质粒DNA载体的稳定性主要与肌细胞的分化终末特性及多核特性有关^[9]。Danko等^[4]的研究发现，肌注的外源DNA以非甲基化的方式存在于细胞染色体外，并不与染色体发生整合，也不进行复制，并且表达水平受肌细胞有丝分裂率影响，分裂加速的肌细胞，对外源基因丢失亦加速，表达水平下降。作者同时指出，共价闭环的外源质粒DNA载体较线状构型更利于表达。也有作者认为，肌细胞对外源基因的持续表达与肌细胞分化终末特性有关外，肌细胞表面MHCI类抗原较少，因而不易被活化的特异性CTL溶解，使质粒DNA得以长期存在于肌细胞内^[1]。此外肌细胞合成分泌的外源存在于产生的特异性抗体可以形成抗原抗体原合物，并沉积于树突状细胞表面，可长效释放Ag，诱导产生记忆性T、B细胞^[1]。

1.3 肌注途径中外源基因表达产物的提呈机理。目前关于肌肉组织中的抗原提呈机理提出了三种假设^[1，9～14]：（1）肌细胞表达外源性DNA，并自身将抗原提呈给T、B淋巴细胞；（2）肌细胞表达并分泌外源性抗原，或由于肌细胞的损伤、局部炎症以及活化CTL对转染肌细胞的毒性作用使表达的蛋白抗原释放于细胞外。这时定居于肌肉组织中，或循环经过的专业APC细胞承担下一步致敏免疫系统的任务；（3）DNA免疫时直接转染APC细胞，通过抗原加工呈递，最终诱导免疫应答。参与DNA免疫的专业APC细胞可以是定居于肌肉组织中的APC，也可以是血循环经过注射部位的APC细胞。Rouse等^[12]亦发现巨噬细胞有摄取质粒DNA表达载体的功能，其表达分泌的蛋白抗原随后由树突状细胞参与加工，提呈。有些学者将质粒DNA表达载体注入小鼠左心室壁中，发现心肌组织与骨骼肌一样，要摄取外源基因，持续表达至60天左右^[13]。但与肌骼肌不同，心肌组织对启动子的组织特异限制较骨骼肌明显，且表达量常受激素调节^[14]。

2 皮内注射

与肌肉注射相比，尽管内注射转染率较低，但高的转染率并非决定免疫效果的唯一因素。皮肤组织由于代谢较快，导致外源基因产物的表达为一过性。但该部位具有很多参与抗原提呈的细胞，通常只需极少量的DNA疫苗即可诱发长时间的保护性免疫。Raz等^[15]皮内一次性注射0.3～15µg裸DNA，诱导产生的特异性CTL可持续达68-70周，并且产生的抗体滴度也较同剂量DNA肌注免疫为高。皮内注射转染较低，但仍具有很好的免疫效果，原因可能是：①角质细胞可分泌IL-1及TNF-α，活化淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞；②含有丰富的郎罕氏细胞，可将抗原携带至局部的皮肤相关淋巴组织中，激发初始免疫的作用；③巨噬细胞、树突状细胞提呈抗原起维持免疫反应的作用；④存在外周血循环中的嗜表皮T细胞可归巢定居于表皮内，诱导皮肤免疫反应；⑤皮肤是具有高水平免疫监视系统的组织，在表皮附近，富含淋巴组织。表皮内APC细胞可被质粒DNA直接转染，或是摄取其它细胞释放的质粒载体，经表达、加工、提呈抗原，诱导强烈而持久的保护性反应。表皮内含有较高浓度的脂皮质素（lipcortin），因此皮内注射不易产生局部炎症反应，并且减轻了长时间表达外源抗原的细胞在局部诱导的免疫应答，有助于抗原的长期表达。作者指出，只要质粒DNA表达载体能够穿过角质层，接近皮肤相关淋巴组织或其他具有免疫活力的皮肤细胞，不论是采用基因枪免疫，直接注射法还是无针注射法，均可产生较好的免疫应答。Hoffman^[16]认为，肌注与皮内注射两条免疫途径并不能绝对分出孰好孰差，应根据不同的目的基因选择合适的免疫途径。

3 鼻内滴注及鼻腔喷雾法

粘膜作为防御大多数病毒、细菌入侵的第一道屏障，在免疫防御中具有重要作用。Cohen^[17]通过鼻内滴注含编码流感病毒抗原的质粒DNA载体，来预防呼吸道病毒的感染。Okada等^[18]报道小鼠鼻内滴注含编码HIV-1抗原的DNA载体，可诱导TH2型免疫应答，在粘膜处可产生高滴度的特异性SIgA抗体，粪便及阴道液中该种抗体含量亦较对照组高，血清中也可检测出高滴度的特异IgG抗体。Okada认为，DNA通过粘膜免疫获得较好免疫效果的原因在于呼吸道具有较大的表面积，上皮覆盖广，存在相关淋巴