摘要 红细胞生成素受体是促红细胞生成素的作用受体，属于细胞因子超家族的成员。近年来，由于其克降表达技术的应用使人们在对造血机制、EPO的信号转导机制，及利用其受体筛选EPO类似物方面的研究有了新的进展。本文综合近年来有关文献对EPO受体的研究作一概括性介绍。

关键词 红细胞生成素受体；克隆；表达；调控；信号转导

Research progress in erythropoietin

Zhang Yinghui

(Institute of Biotechnology, Beijing 100071)

Abstract Erythropoietin receptor(EPOR) is the receptor for erythropoietin which accounts for the regulation of blood cell formation. It belongs to members of cytokine superfamily. During past few years, researchers begin to have a more clear view of mechanism of blood production, genetics of blood disease, signal transduction by EPO, and study about screening EPO mimetics. The review based on the relevent research articles give a summary of knowledges of EPOR published during past years.

Key words erythropoietin; cloning; expression; regulation; signal transduction

红细胞生成素（erythropoietin,EPO）是哺乳动物红细胞生成的主要激素调控子，对于红细胞前体细胞的生存、生长、分化、成熟具有重要的作用。为了进一步探讨EPO作用方式，有必要对其和其受体的相互作用有深入的了解。但由于这些受体数量的稀少和表达的不同阶段性，使得研究受体有很大阻碍。1989年鼠EPO受体（EPOR）的克隆解决了这一关键性难题，这使得人们开始利用各种克隆表达体系对EPOR的结构、蛋白性质、表达调控和信号传导问题有了深入的了解。通过克隆鼠和人EPOR在两方面取得了重要的进展：首先，EPOR的结构表明，它的膜外域包括4个共分布的半胱氨酸和预测的成对的β-链配体结合域，以及近膜区疏水的wsxws结构。这都说明EPOR是造血受体超家族的成员。其次，人鼠受体的克隆使得人们有机会通过转染实验和造血细胞系突变，受体功能的重建来确认调节增殖信号功能域和辅助因子，从而使人们更加细致地了解细胞的信号转导。而EPO介导的分化则尚未在模型系统中得到重现。这一领域研究对象模型仅限于红白血细胞病细胞系或分离的正常红细胞前体细胞。可以说，这方面的问题是今后克隆表达技术完善的一个突破口。本文从EPOR克隆技术的发展、EPOR的结构、功能、复合体的形成、hEPOR基因的表达调控、EPO介导的信号转导、EPOR在医学研究中的应用这几个方面作一个回顾性的介绍。

1 EPOR的克隆

EPOR的克隆是由于当时对红细胞生成素引导的红细胞增殖分化的了解甚少，而且这至少在一定程度上是由于普通红细胞与红白血细胞系表面受体过少（不足1000 ePOR/细胞^[2]）所致。最早的开创性研究在1989年^[1]，通过cos细胞表达战略来完成了鼠EPOR的cDNA克隆。

这项研究工作是从表达EPOR的鼠MEL细胞构建一个cDNA文库，而后将其转染至cos细胞。通过对¹²⁵I-EPO的结合与吸收来筛选cos转染子。这种方法一共筛选了两个克隆：克隆141（19kb），克隆190（18kb），且酶切图谱相同。而后又将其亚克隆至M13mp18或M13mp19载体，用链终止法确定了其核苷酸顺序。此研究的意义在于①揭示了mEPOR的编码核苷酸顺序，即单一的开放型507bp的阅读框架，3'端另有167bp，且有poly（A）尾巴；②EPOR有3个结构域，即N端含有24个残基的典型信号序列的胞外域，以α螺旋形式的膜区及胞内区；③有2个N端基化位点，一个在胞内，一个在胞外；④交联反应发现了另外两个与EPO交联的蛋白，分别为85×10³、100×10³；⑤MEL细胞仅有单一纯合性的受体，而cos细胞则有高低两种亲和性受体，分别占14%、86%。

随着小鼠EPOR cDNA的表达克隆，使得人的EPOR的结构研究成为可能，通过mEPOR的序列而设计成的探针，1990年^[2]筛选人胎肝cDNA文库克隆出一个编码人75%EPOR序列的克隆ER2 cDNA，并筛选基因组文库克隆了编码5'外显子序列的基因组DNA，将二者信息合并，推导出人EPOR的一级结构。

此工作的意义在于：①证明了人EPOR共有508个氨基酸，分子量为55.24×10³，其序列与小鼠有82%的同源性；②利用ER2所做探针通过原位杂交技术确定了人类EPOR基因位于19p位置，并证实有些人红白血病细胞系（TF-1），其19p上有多余的基因物质。这在病理学某种程度上阐述了EPOR基因结构或表达方面的异常对于红白血病的致病有着重要的意义。

这方面的同期工作还有^[3]，EPOR的cDNA从由OCIM1细胞提取poly(A)RNA组建的cDNA文库中筛选，探针亦为mEPOR的酶切片段（克隆190）^[1]，并辅之以用人胎肝cDNA文库中EPOR cDNA PCR扩增产物做验证。克隆出了18p片段，编码EPOR的全长。并证实，与小鼠的糖基化位点不同，hEPOR的胞内域缺少N-糖基化位点。两次工作也都表明cos细胞中表达的受体都是66X103，与计算的差异可能是由于糖基化所致。

以上所及都是针对EPOR cDNA克隆所言，随着其编码序列的确定，人们开始把EPOR基因克隆与cDNA克隆相结合^[4]，从而第一次较全面地使人们认识了EPOR的整个基因结构，并为以后的表达调控研究奠定了基础。

基因组的克隆一般采用人胎盘EMBL3文库，用hEPOR cDNA作探针，而后将克隆再亚克隆至puc18载体，从而进行测序，其外显子与内含子序列的边界则由OCIM1 mRNA的PCR克隆所得的cDNA序列相比较而[^4]确定。对于cDNA文库的克隆，同时期的工作编码，所使用的两个人cDNA（骨髓，胎肝），其获得的EPOR cDNA克隆通过与mEPOR cDNA的和hEPOR的全序列综合比较，发现所用的人cDNA都是非正常的，它们都包含着额外序列或未切割的内含子、异常插入序列，内含子外显子交界处的新插入序列。

EPOR cDNA和基因结构表明，hEPOR的基因位于19p，接近着丝点。共有8个外显子和7个内含子。外显子包括5'非翻译端、信号肽区域及胞外域的氨基端域。外显子6编码单一的跨膜区。胞内区由外显子7、8编码。外显子的大小是从87bp(外显子6、7)到大于800bp（外显子8）；而内含子序列从0.08kb到2.1kb，并包含与Alu高度同源的重复序列。此基因3'端不包括poly(A)加尾信号（AATAAA）。人、鼠EPOR基因有着高度的同源性，这主要体现在它们的编码序列和5'端调控枢。5'端小鼠序列在-146bp和-147bp位置包含转录起始位置，人与之对应于-133、-134或-137bp位置。另外人序列从-146～-185bp与小鼠-161～-200bp有80%的同源性，并且包括可能的调控序列SP1结合域（CCGCCC），造血细胞系特异转录因子GATA-1结合域（TTATCT）。hEPOR序列从-80～-104bp包括一个回文序列（CAGCTGCGTCCGGCGGAGG-CAGCTG），这一点与小鼠不同（小鼠没有回文序列）。另外比较重要的一点是，人EPOR不包括CAP位点上游的TATA或CAAT序列，而这个位点通常为转录因子和RNA聚合酶结合位点，来支持转录的基础水平。

2 EPOR的蛋白性质、结构、功能域及复合体的产生

EPOR DNA被克隆后，从序列长度推算其分子量为55.24×10³。 但从细胞上分离下来的EPOR分子量为64×10³或66×10³。这往往是糖基化的缘故。但1993年的研究表明，EPOR的功能形式是一种78×10³的分子^[5]。这基于以下几种事实：①HCD57小鼠红细胞当缺乏EPO刺激时，出现78×10³的EPOR增多；②用抗NH-端抗体探寻这些细胞的完整表面时只发现78×10³的EPOR；③酶促脱糖基化、脱磷酸化表明，这种EPOR是62×10³EPOR的N端糖基化所致；④抗磷酸化酪氨酸抗血清处理时，发现这种78×10³EPOR的磷酸化是依赖EPO刺激的，且在EPO刺激下，这种受体的代谢速率比没有EPO刺激时要高；⑤COS细胞暂时表达EPOR cDNA，发现除64×10³、66×10³两种预期受体外，可能还有微量的78×10³EPOR存在。也许正是由于功能受体的微量才导致COS细胞没有EPO应激反应性^[1]。

EPOR的最初基本结构由克隆的鼠的EPOR来解释，其编码507个氨基酸残基，且有一个类型1的跨膜蛋白域。前24个氨基酸残基形成一个信号肽，而其余的483个氨基酸残基包括胞外223个氨基酸残基的激素结合域，24个残基的跨膜域和236个氨基酸残基的胞内域。胞外域有造血受体超家族共有的两个特征：一套4个的半胱氨基酸残基和一个Trp-Ser-X-Trp-Ser的近膜结构。同时具有这类特征结构的其他细胞因子受体包括：IL-2、3、4、5、6、7、9，GM-CSF，LIF，GH，催乳素，神经因子等。

EPOR共有3个功能域，通过EPOR的胞外域与IL-3Rβ₁₁₃胞内域组成的嵌合体的研究发现^[6]。它们都能赋予表达细胞（Ba/F3）的分化特性。这表明受体的胞外域实际上是EPOR的关键分化功能域。而通过对EPOR胞内不同区域的删除发现两个功能相反的区域；近膜的大约100个含丝氨酸的区域传导增殖信号，而远离羧端区域下调这一信号，起到负调控的作用，具体位置大约在羧基端40～90个残基的区域内^[18]。

以上是克隆cDNA的基本结构。但随着克隆表达的研究及与¹²⁵I-EPO交联分子的综合研究发现，组成EPOR复合体<