摘要 新基因克隆是当今生物学最热点的领域之一。本文从技术原理、适应性及使用例证等方面，综述和评价了已有的及发展中的新基因克隆技术，包括克隆已有多肽分子的基因、同源家族基因克隆、功能性筛选、差异及减数筛选等，并着重介绍了RDA、EDS、RLCS等差异筛选技术。

关键词 新基因；克隆

分子遗传学在理论上的重大突破，以及70年代后限制性内切酶的发现，质粒作为载体的应用，共同推动了DNA体外重组技术的发展，使分子的基因克隆成为可能。迄今，这项技术已不断地发展完善，不仅能用来克隆已知分子的基因，而且成功克隆了一些未知分子，从而大大推动了分子水平的研究。本文以阐述基本原理为主，介绍目前用于克隆新分子基因的方法及其应用等。

1 克隆已有多肽分子的基因

在已获得纯净多肽分子的条件下，可采用多肽序列指导引物合成的方法，用PCR技术以靶细胞特异mRNA为模板合成相应cDNA。或者在拥有足量多肽的情况下，制备抗该多肽的抗体，并以此从表达性文库中筛选阳性克隆。其基本原理阐述如下。

1.1 多肽氨基末端序列指导PCR引物合成法

对高度纯化后的多肽分子作N-端氨基酸序列分析。根据氨基酸序列反推出这部分相应的基因序列，并据此指导mRNA5′端的引物合成。同ZAP等表达性载体构建的细菌表达性文库。同时，依据mRNA3′端poly-A(多聚腺苷酸)序列指导合成poly-T(多聚胸腺苷酸)的3′端引物。继而，用PCR技术从制备细胞的mRNA或直接从胞浆内溶物中合成出相应的cDNA。依据设计引物时引入的酶切位点，将该cDNA克隆到可表达性载体中进行产物表达^[1]。这一方法较适用于难于获得足量多肽、并可用特殊技术得到微量纯品的分子。

1.2多肽特异性抗体筛选表达性文库法

该技术路线首先用拥有的多肽分子制备出特异性抗体（多克隆或单克隆抗体）。依据抗原抗体特异结合反应，用标记了示踪物的抗体从相应表达性文库中筛出阳性克隆。早先，这项技术多用λgtll,λZAP等表达性载体构建的细菌表达性文库。将印有细菌裂解碎片的膜浸于含抗体的溶液中孵育,最后以放射自显影或组织化学得到阳性克隆。这种细菌文库筛选法局限于免疫原性蛋白质的筛选。后来，随着哺乳动物细胞表达性文库的建立，使本方法的应用推广到细胞内活性肽、表面抗原及受体分子的克隆。

2 克隆已知序列基因家族新成员

哺乳动物细胞在进化过程中，产生出许多具有高度同源性的基因，称之为基因家族。利用家族成员基因同源性很强的特点，可发现并得到新分子的基因。

2.1同源探针筛选法

用已知分子的高保守序列指导同源探针制备，以此探针从相应文库中筛选出阳性克隆。为确保所得的新基因，还必须进一步通过核酸序列分析或其它手段鉴定^[12]。在缺乏全同源探针的情况下，可用其它种属的相关基因指导制备探针。用这种部分同源探针来筛选与探针序列相关但不完全相同的基因。该法往往需要摸索核酸杂交技术条件，以降低背景杂交干扰。

2.2 PCR放大建库法

分别用已知基因的5′端和3′端的高保守序列指导合成PCR引物。以此引物从靶细胞中PCR扩增出含引物序列的所有cDNA。并将其建成3′到5′端都含已知基因同源序列的cDNA文库。以此文库逐个进行酶谱分析。在确认存在酶谱差异的情况下，进一步进行新基因鉴定^[2]。

3克隆已知生物活性的新分子（功能性筛选）

基于真核细胞可使源于真核生物的基因表达出具有生物活性多肽的特点，用其所建的表达性文库可直接用于多肽生物活性的克隆筛选。

80年代中期发展起来的真核表达系统，首先是将由mRNA制备的cDNA克隆到穿梭质粒载体中，再转染特定型的靶细胞（多用cos细胞），使插入cDNA得到表达，建立表达文库。然后，根据实验者的目的的及新分子的生物学特征，采用适当的方法从该文库中筛选分离出阳性细胞克隆。因此，生物活性筛选法的选用。主要依赖于所研究分子的生物活性特征。例如：可用抗体筛选抗原；用底物筛选酶；用配体筛选受体等等。现列出几个实例说明此类方法的多变性。

Aruffo和Seed提出一种方法来筛选细胞表面的抗原或其它小分子^[3]。用包被着抗体或配体的平皿筛选表达文库的细胞，可与平皿结合的细胞即为表达相应目的分子的阳性细胞，利用直接裂解法从这些细胞中回收质粒。重复筛选两、三轮后，最终得到目的基因。

Yanasaki等用FACS分析成功地克隆了IL-6受体细胞克隆^[4]。

这类方法均基于阳性克隆细胞的大量扩增及多轮筛选，故工作量较大。Ward等提出免疫聚焦（immuno-focal）确定阳性细胞的方法^[5]。他采用酶联免疫显色筛选（enzyme-linked immuno-colour screening）从表达性文库中直接筛出所需的细胞。其作法为：使表达性文库细胞依次与第一抗体和β-半乳糖苷酶标记的第二抗体结合，再通过底物反应使阳性细胞着色，借助显微镜用毛细管取得单一阳性细胞。经克隆扩增获得大量阳性细胞。

运用表达性文库活性筛选应具备：①全长cDNA，以便能进行活性表达及筛选；②所用载体要具有高表达特性；③高效转化方法。目前引入的逆转录病毒载体转导系统大大提高了转化效率^[6]。如果所需基因能够改变细胞表型，又可进行选择或利用细胞培养筛选，这种方法就更为便利。

4 筛选细胞分化表达基因

细胞在增殖、分化及对外界刺激反应过程中，可伴随某些特殊基因的表达。利用细胞这一特性，通过比较细胞在不同状态及不同分化阶段基因表达的差异，来发现分化表达基因。这是以反向生物学原理发现新分子的技术。其主要方法介绍如下。

4.1建立减数cDNA文库筛选分化表达基因^[2]

减数文库（subtracted cDNA library）只包括那些在实验组细胞中特异表达的基因。传统建库方法是以差异筛选（differential screening）排除对照组与实验组细胞中相同的基因成份而建立减数文库。将实验和对照组细胞的cDNA文库都用限制性内切酶切割成片段，并将对照组cDNA片段用S1核酸酶切平，然后以数种限制性内切酶将其切成很小的片段。将实验组和对照组的cDNA片段混合，通过变性及再复性过程，使来自对照组小的cDNA片段与实验组中的长链cDNA杂交。两库中相同的基因杂交形成带单链DNA的杂交体，那些只在实验组中存在的cDNA将只与其原始互补链杂交，并保存粘性末端。将那些有粘性末端的杂交分子连接至噬菌体载体中，建成减数文库。进一步从该文库中筛出实验组细胞中特异表达的基因。

差异杂交（differential hybridization）比较简单可靠，但只适用于样品表达mRNA较丰富、差别较大时；而减数杂交（subtractive hybridization)适用于表达量较稀少的mRNA时，但需要经验且成功率较低。这种传统方法较费时费力，且对于高度复杂的人类基因组，减数杂交难于达到完全有效的杂交。

4.2PCR放大差异分析

差异展示PCR(differential display pCR,DDPCR)和差异显示分析（representational difference analysis,RDA）是两项基于PCR扩增原理展示两种细胞内基因差异的技术。

1992年,Liang等报道了DDPCR方法^[7]。基于随机引物放大原理，用PCR技术以对照组和实验组细胞的全部mRNA为模板合成cDNA。通过两组细胞群cDNA的平行测序电泳，分析比较两组细胞的cDNA差异，进而从凝胶中分离出差异区带作进一步分析。DDPCR较传统的建立减数文库再杂交筛选的方法更快速有效，但由于对细胞全体mRNA均作放大，工作针对性不够强，而且容易出现假阳性。

1993年Listsyn等报道的展示差异分析(RDA）法对克隆新基因的技术有了进一步改进^[8]。它保持了快速有效的特点，同时通过特异放大分化差异基因片段，解决了传统方法杂交不完全的弊病。

从实验组和对照组基因文库中酶切DNA片段，然后将实验组文库的DNA5末端连上设计的寡核苷酸链（adaptor）。将实验组与过量的对照组DNA混合。经变性再复性过程后，只有来自实验组的自我复性（selfreannealed）差异分子双链5′端均合修饰物。通过补平所有双链3′端，采用相同寡核苷酸序列为引物，以PCR将双链的两端都含修饰物的差异分子以指数级放大，对照组与实验组同源的成分也可形成杂交分子，但只有单末端含修饰物，加上PCR循环中过量对照组DNA的竞争抑制作用，故杂交分子仅以线性放大。最后通过电泳分析或将占优势的差异分子克隆至载体等方法获得新分子基因（图1）

图1 RDA的操作步骤图解

4.3 酶降解减数cDNA文库的建立

Zeng等于1994年报道了一种新的建库方法，酶降解减数cDNA文库法（enzymatic degrading subtraction,EDS）^[9]。此法以PCR分别扩增实验组和对照组cDNA文库。用Klenow外切酶由3′→5′方向部分切除实验组cDNA3′末端碱基，再以Klenow多聚酶由5′→3′方向将被外切酶切除的部分用硫代三<