摘要 本文简述了基因免疫的发展历程，研究现状和一般技术步骤，探讨了这种新免疫形式的优点和至今仍提忧的问题，指出理想的基因免疫应基于基因组水平，开发染色体真核表达载体，以近自然的方式实现对免疫过程及疾病的控制。

关键词 基因免疫 疫苗 载体 基因治疗

基因免疫的概念与实践诞生于90年代初，发展势头迅猛，世界许多实验室纷纷投入这一新开辟的领域，希望研制出廉价而有效的抗病毒、抗肿瘤等重大疾病的疫苗。

基因免疫（genetic immunization），亦有核酸免疫（nucleic acid immunization）、DNA免疫（DNA-based immunization）、DNA疫苗（DNA vaccine）（也有尝试使用mRNA免疫的^[1]）等各种名称和相关概念。普遍认为，基因免疫的出现标志着第三代疫苗的开创，有人则直呼之为第三次疫苗革命。第一代疫苗以Jenner用牛痘接种人体防治天花，Pasteur研制出减毒狂犬病疫苗为代表，直接将完整的病原体在无毒或减毒的情况下接种人体，使之产生特异性免疫记忆反应，起到预防疾病的作用。这一代疫苗为消灭天花、麻疹、脊髓灰质炎，预防甲肝流行等传染病立下不朽功勋，应该说医疗史上最成功的例子就是这些疫苗开创的。第二代疫苗出现的时间并不长，当人们能较自由的运用基因工程技术时，很自然地会分离具有强烈免疫原性的抗原蛋白相应基因，以重组蛋白的方式生产含优势表位抗原作为疫苗，甚至可以将不同病原体来源的抗原区段人工连接起来，为亚单位疫苗。重组乙肝疫苗是典型的例子。机体对抗原的攻击产生特异性免疫反应是针对蛋白的，而蛋白是基因一个个核苷酸顺序编码的，如果不接种蛋白而直接把其编码信息“告诉”机体，会不会也产生免疫反应呢？基因免疫正是这么考虑的并且作了了肯定的回答。基因免疫就是将编成目的的抗原的基因以重组表达载体的形式经各种基因转移途径转入机体细胞，借用宿主细胞的表达加工机构合成抗分子，以MHC-Ⅰ和/或MHC-Ⅱ类分子抗原处理和输送途径将抗原信息递呈T淋巴细胞，从而激发体液免疫和细胞免疫。可见基因免疫综合了减毒疫苗和亚单位疫苗的精髓，既象接种了活的病原体可以不断表达抗原蛋白，又可以方便地精选所需基因片段，以激发理想的免疫反应。De-chu tang进行了这项开创性的实验；他把人生长激素（human growth hormone,hGH）重组质粒以金颗粒包被的形式轰击入小鼠耳部皮肤，做免疫沉淀和免疫印迹证实有抗hGH抗体产生，又用hAAT(humanαl-antitrypsin)重组质粒免疫也得到阳性结果^[21]。Merck实验室的Margret liu和她的同事随后的报道了直接注射甲型流感病毒保守的核蛋白抗原基因表达质粒于小鼠能使之免于该疾病，基因免疫从此进入医学和疾病预防研究^[3]。之后，关于基因免疫的文献越来越多，有的开始用黑猩猩等人灵长类动物作实验，有的则已进入临床实验^[4]。

谈基因免疫就不能不提基因治疗。经典的基因治疗指针对遗传缺陷在基因水平进行的纠正。现在广义的认识已为凡是在基因水平操作而达到治疗疾病目的总称。因此，基因免疫也应当包括在这一范畴之中，其重组载体的构建、基因转移、最终医疗目的与基因治疗并无本质不同。只是一般其编码的蛋白不直接产生治疗作用，而是间接通过激发免疫系统的特异性免疫反应而发挥作用的。相比之下，基因治疗的思想和实践要久远、丰富得多。现在一论及基因免疫基本会谈到“直接DNA注射”，“裸露的DNA输送”其实这一技术的开创者Walff^[5]在发现裸露的DNA注射到肌肉可被吸收并表达出蛋白质时，他意识到一个新的基因转移途径，简捷、直接，预测有着广泛的用途，他是围绕基因治疗设计这一实验并发现此事实的，当时还没提出基因免疫的概念。

基因免疫的方法经过几年各国科学家的努力，已比较成形，象Walen提出的Twelve-step program for DNA Vaccine，其大致步骤为：

1.目的基因的分析，包括是否能在哺乳动物细胞中表达，是否含有稀有密码子，有无内含子以及能否在哺乳动物细胞中正确剪切。

2.选择合适的表达载体，基因免疫选择的载体主要是质粒，因为质粒可以用大肠肝菌作为生物工厂大量生产，而不能在哺乳动物细胞中复制。常用的有pSV2、pRSV、pCDNA3.1和pCI，这些载体一般都设计有真核基因表达调控序列，例如CMV（巨细胞病毒）早期启动子/增强子/BGH（牛生长因子）poly(A)尾，另外还有MCS（多克隆位点），原核筛选标志Ampenicillin抗性基因，真核筛选标志Neomycin或Zeomycin抗性基因，以及可使质料在大肠杆菌中保持并多拷贝复制的序列ColEl。新一代载体多设计有可供重组质粒体外转录/翻译实验的T7噬菌体RNA聚和酶结合的启动子序列。

3.通过测序确认编码序列，尤其目的基因是采用PCR克隆的方法获得的时候，因为Taq酶缺乏3'-5'外切的校正作用，有一定的错配率，避免突变尤其无义突变的发生。

4.利用兔网织红细胞裂解物体系进行体外转录/翻译实验以确保目的蛋白能在哺乳动物细胞翻译机制合成，然后用CHO、COS、HepG2等哺乳动物细胞系做瞬时转染实验，确保载体能正确的指导目的蛋白在哺乳动物细胞中合成；用免疫荧光、免疫印迹或免疫沉淀等方法检测。

5.进行动物实验，多自小鼠开始，肌肉注射质粒或颗粒轰击，5-6周后加强（2周会有抗体出现，4-8周臻于高峰，要避开反应高峰加强，否则抗原会被中和而起不到免疫刺激的作用），视情况再加强一次或不加强，检测抗体反应和CTL（cytotoxic T lymphocyte）活性。动物品系的不同可能影响免疫反应的效果，应该多试几种品系。关于质粒用量，一般认为肌肉注射需100μg左右/次，基因枪法要少得多。绝大多数实验肌肉注射之前要对肌肉进行预处理，常用Bupicaine或cardiototoxin，使肌纤维选择性破坏，成肌细胞再生，利于质粒的摄取。亦可用exvivo的办法，体外培养肌细胞并转染质粒，将筛选到的转染细胞回植。Wolff作了肌肉的细胞摄取裸露质粒DNA机理探讨，认为与T管和细胞膜小窝有关，但没有观察到内吞的证据^[6]。

6.结果评价和实验设计优化

同基因治疗一样，基因免疫所用的基因转移方法很多，甚至有用汽枪注射质粒溶液。不同的途径影响免疫效果乃至决定免疫类型。目前常用的为肌肉直接注射和金颗粒包被裸露质粒基因枪轰击两种方法。注射法可将质粒直接注入肌肉、皮内、皮下、免疫器官以及血液。肌肉注射最原始，研究最充分，效果也好，T_H1和T_H2辅助的免疫反应都能产生，尤其是T_H1辅助的MCH-Ⅰ类分子限制性的CTL细胞毒免疫反应^[7]更令人瞩目。金颗粒包被轰击法所需核酸量较前者少1000倍，而且能诱发强烈的T_H2介导的γ-IFN释放型的IgG体液免疫反应，CTL反应则常不显著。因此，目的蛋白能诱发保护性抗体免疫反应的话，以高压氦气为推动力的基因枪轰击法不失为一上策。但是象HCV核心蛋白产生的抗体没有保护作用，就必须着重于基于CTL的特异细胞免疫反应夰多采取肌肉注射的途径。现在有科学家试验口服的DNA疫苗，试图在粘膜局部免疫方面一展身手^[8]。

基因免疫用质粒的制备必须高度纯净，尽量减少内毒素的含量，否则难免引起实验动物发生炎症样反应，干扰实验的可靠性和重复性，何况基因免疫的最终应用是临床。基因工程产品在此方面有严格的规定。目前一般有两种方法可选择：CsCI密度梯度离心，这费时费力且有溴化乙锭（EB）的污染处理问题；另外就是阴离子交换色谱（AX）方法，内毒素去除可与两轮CsCI级相比。内毒素在表面活性剂存在而Ca²⁺、Mg²⁺二价阳离子去除的情况下，不再成高分子聚合态，分子量小于10000时生物活性随之丧失，因此可以用适当截留分子量的超虑来去除。更为先进的用亲合层析的方法，例如将LAL（LPS底物）或PMB（多粘菌素B）偶联于CHBr-Sepharose或NHS-Sepharose上可特异性吸附内毒素。

基因免疫的优点是无庸置疑的。其化学上是比蛋白质稳定得多的DNA，便于保存和运输，很适合作疫苗；在设计构建生产方面，操作DNA要比生物蛋白抗原分子简单得多（去除内毒素问题，重组蛋白抗原亦面临引问题），可很快地获得抗原基因，根据基表位的特点进行分子设计，这对于对付象HIV、HCV这样经常发生变异的RNA病毒来说尤其显得重要，可以近似同步地跟踪病毒相似株的演变，直接瞄准病毒优势克隆进行免疫攻击；从免疫效果上说，最在好处在于最有意义的抗原基因模拟减毒活疫苗编码正确折叠的糖基化抗原分子，借人工方法获得天然的免疫形式，有利于病毒的彻底清除。除了预防和临床的需要，人们还可以借助基因免疫详细研究免疫产生的机制，尤其是CD8T细胞介导的MHC-Ⅰ类分子限制的细胞免疫反应；模拟减毒活疫苗，研究抗原处理和表面递呈过程、免疫识别的细节。还有就是记忆性淋巴细胞的产生和维持。

最近瑞典Paul Klenerman在《Nature》上报告这样一个发现，淋巴细胞络丛脑膜炎病毒（lymphocyte choriomeningitis virus,LCMV）这个非逆转录RNA病毒可受特定宿主细胞的内源性逆转录酶作用而以互补DNA的形式长期在存于宿主细胞中，造成终身免疫，看来自然界早就学会了基因免疫并将它用于免疫记忆^[9]。这样，象淋巴器官内B细胞和巨噬细胞等抗原递呈细胞即使在MHC复合物低水平的情况下也会由于本身含DNA将功疫苗而发挥巨大的免疫作用，还有免疫耐受的产生和维持。总之，许多生物学基本问题的解决，基因免疫的理论和实验会提供很大帮助。运用基因免疫的方法还可制备单克隆抗体，绕开抗原制备过程中纯化复性等复杂步骤。正因为这样