摘要本文综述了目前研制的O139群口服菌苗，包括灭活菌苗、基因工程减毒活菌苗和基因工程加法菌苗；阐述了有关O139群菌苗的基础研究，包括O群和O139群的分子遗传学关系、O139群感染的免疫机制和产生的保护机制。

感染O139群的病人大多数为成人，显示以前感染O1群也许会引起第8次霍乱世界大流行。目前O139群仍然主要流行于印度和孟加拉国，在东南亚其他几个国家散发，在世界范围内仍以E1 tor型（EVC）流行为主。EVC自1991年开始在中南美洲引起较大规模流行，至1994年报告病例数累积超过一百万，中美洲在1991年以前近1个世纪里只有霍乱散发的报道。以此借O139群借已被证实具有在未免疫人群中引起并扩散的能力，故O139群被认为是一个严重的公众健康问题。在O1群菌苗研制的基础上，研制出有效的O139群菌苗，对于霍乱流行的国家和地区很意义^[2，3]。

一、O13群和O139群的分子遗传学关系

目前霍乱弧菌根据Ｏ抗原不同已分为155个血清群，只有O1群古典型（CVC）、EVC和O139群能引起大流行，这主要是由于其含有霍乱肠毒素（CT）和菌毛等毒力因子，其分别由CT基因簇及TCP等毒力基因编码^[1]。

众多学者利用脉冲凝胶电泳、rRNA基因探针分型、CT基因探针分型、任意引物PCR和多位点酶电泳等方法，对世界不同地区分离的霍乱弧菌O1群和O139群菌株进行分析，发现不同地区分离O139群菌株的分型结果基本一致，与引起世界地区性大流行的EVC型分型结果相似。EVC和O139群的CT基因和TcpA基因的序列也基本一致。说明O139群和EVC在遗传上密切相关。目前认为能引起霍乱流行的O139群起源于EVC，由EVC发生O抗原基因重组形成^[4-6]。

Shan 等自阿根延一病人分离出1株CT阴性的O139株，经核糖分型等分析表明该O139株与EVC在基因上均有较大差异，提示其不是起源于EVC，而可能是由其他非O1群霍乱弧菌发生基因重组获得O139株群的O抗原基因，从而形成的变异株，这也提示O139群可能存在多个起源。O139群和EVC虽然在遗传上密切相关，但仍存在一些本质区别，主要包括O抗原和耐药性等方面。O1群只表达脂多糖O抗原，O139群也表达脂多糖O抗原，但多糖链的成分和结构与O1群的不同。O139株还可表达一荚膜多糖，故对血清裂解反应具有较强的抵抗力，可使感染O139株的病人产生败血症。人们克隆了O1群和O139群的O抗原基因，发现两者编码脂多糖rfb位点只有很少的同源性。经序列分析发现O139群失去了O1群的O抗原基因，但具有约36kb的新基因，编码与O1群不同的脂多糖原和荚膜多糖^[8]。

在许多O139群分离株中，存在一活跃的前噬菌体。促进O139群的菌株与外环境之间进行基因重组，从而获得新的毒力基因，故O139群的菌株比O1群的菌株易于发生变异^[9]。

O1群和O139群的耐药谱不同，许多O139群分离株对大量抗生素耐药，从而使对它引起疾病的治疗更复杂。O139群的耐药机制与染色体基因和质粒均有关。Walder等^[10]在O139群染色体基因组中发现一约62kb片段，含有该片段的菌株对SMZ、TMP、链霉素和呋喃唑酮（痢特灵）耐药。Yamamoto等^[11]在O139群菌株发现一质粒，含有该质粒的菌株可对氨苄西林、四环素、卡那霉素、庆大霉素、SMZ和TMP耐药。

二、O139群感染的免疫机制和产生的保护机制

预防霍乱等肠道腹泻病的免疫基础主要是肠道局部粘膜免疫^[12]。霍乱弧菌等致病菌首先与肠道相关淋巴组织，如与小肠集合淋巴结和大肠淋巴滤泡等作用，刺激能产生IgA抗体的前体B细胞（又称为抗体分泌细胞）。这些前体B细胞转移至肠系膜淋巴结，经胸导管，再通过体液循环分布到体内各分泌组织，包括肠道的固有层，分化成熟的浆细胞，产生分泌型IgA。肠道中的分泌型IgA与致病菌结合后能有效地阻碍其在肠粘膜的定居，并能中和病原菌产生的毒素。

患过霍乱可获得较牢固的免疫力，再感染者少见。对O1群多年的研究表明，感染霍乱弧菌后，机体可产生抗菌免疫和抗毒素免疫。前者主要是针对脂多糖O抗原，后者主要针对霍乱肠毒素B亚单位（CT-B）。在霍乱菌苗的研制中，脂多糖O抗原和CT-B也是最主要的保护性抗原。

O139群的免疫机制与O1群的基本一致。抗菌免疫主要针对脂多糖和荚膜多糖，抗毒免疫主要是针对CT-B^[13，14]。O139群比O1多一个表面抗原即荚膜多糖，在小鼠实验中发现，先给小鼠服用亚凝集剂量和抗荚膜多糖抗血清，再用O139群产毒株进行攻击，小鼠不发生腹泻，经进一步研究证明该抗体可抑制O139株在肠粘膜上定居。经家兔肠段结扎实验和小鼠攻击实验证明，在针对O139群以保护性免疫为主，以针对CT-B的抗毒免疫为辅，而且两者可以协同反应，增强保护作用。

三、目前研制出的O139群菌苗候选株

（一）口服灭活菌苗

Jertborn 等^[15]在O1群单价口服灭活菌苗的基础上研制出O1群和O139群双价口服灭活菌苗。单价菌苗每剂含1.0mg经基因工程制备的重组CT-B，甲醛灭活的EVC iaba弧菌0.5×10¹¹个，甲醛灭活的CVC Ogawa弧菌0.25 ×10¹¹个，热灭活的CVC Inaba弧菌0.25 ×10¹¹个,热灭活的CVC ogawa弧菌0.25 ×10¹¹个。双价菌苗只是在单价菌苗中加入甲醛灭活O139群弧菌0.5×10¹¹个。加入的O139群菌株能稳定地表达高水平的O139群脂多糖和甘露醇敏感的血凝质，不能够表达荚膜多糖。

在38名志愿者中检验双价菌苗的安全性和免疫原性。20名志愿者给予双菌苗，分隔2周给予2剂菌苗，其中12名在第2剂菌苗接种后5-6周接种第3剂菌苗，其余18名志愿者接种单价和双价菌苗。两组志愿者，服苗后的反应相似，70%-80%的志愿者无任何不适反应，20%-30%有轻度的反应，反应主要是轻度腹鸣。根据过去现场接种单价菌苗的经验，可推测引反应主要是由于服用了菌苗的碳酸氨钠缓冲液引起。

双价菌苗诱导的针对CT-B和O1群霍乱弧菌的血清反应的频度和大小，与单价菌苗结果一致，说明在双价菌苗中加入的O139群霍乱弧菌，并没有影响单价菌苗各成分的免疫原性。接种双价菌苗的志愿者中大多数能诱导针对O139群的肠道和系统抗菌免疫反应。收入12名双价菌苗接种者的血清，检测抗体，发现均产生显著增高的抗毒抗体IgA和IgG。10名产生针对01的显著增高的抗菌抗体（83%），8例产生针对O139群的显著增高的抗菌抗体（67%）。在接种第2剂双价菌苗5-6周后，加种第3剂双价菌苗，各项抗体检测的结果显示基本没有增强免疫反应。上述结果表明双价菌苗的安全性和免疫原性均较好，该菌苗的有待于在较大规模的人群中应用，进一步观察其安全性和免疫原性。

霍乱口服灭活菌苗的研究已有一百余年，但直到本世纪80年代，随着肠道粘膜免疫机制的阐明，以及灭活菌苗在大量人群中应用得到的经验，该类菌苗的研究才取得了较大的进展。在灭活菌苗中加入CT-B，能刺激产生肠粘膜免疫反应，使疫苗的前6个月的效果增强，保护率达到85%，半年后的3年内保护率为50%。开始加入的是来自霍乱弧菌的提纯CT-B，后加入通过基因工程制备的重组CT-B，以降低成本。口服灭活菌苗安全、可靠，但该类菌苗不能在肠道定居和繁殖，故产生的保护力中等，持续时间较短，故产生的保护力中等，持续时间较短，需多次接种，才能产生较高的免疫效果和保护力，费用较高，对5岁以下儿童效果较差。

（二）基因工程减毒活菌苗

制备O139群工程减毒活菌苗，首先将CT基因簇，包括CT、zot、ace和cep等毒力基因去掉，以减低毒力。将毒力基因插入的靶位点RS1序列和将attRS1序列去掉，以防止菌苗位点特异性重组重新获得CT基因簇。将CT-B基因与一启动子相连并插入菌苗的recA基因使之能高效表达霍乱肠毒素B亚单位，同时也使recA基因突变，使菌苗不能通过同源重组获得毒力基因，最后将一药物抗基因如HgR基因插入hly基因，使菌苗具有一选择标志。根据上述策略研制出的O139减毒活菌苗候选株包括CVK112、Bengal-15和Bengal-2。

Coster等^[16]研制出Bengal-15，10名志愿者服用一剂菌苗，每剂菌苗为10⁸cfu（克隆形成单位）加于100ml缓冲液。3名志愿者只服用100ml缓冲液作对照。服苗者均未腹泻，其他病症与对照组一致，这表明其他病症是由缓冲液引起，菌苗对志愿者无不良反应。服苗后2周，10名服苗者中有9名的血清杀弧菌抗体阳性（超过对照8倍）。服苗后1个月，对7名服苗者进行攻击试验，3名服缓冲液者和3名未参与免疫者作为对照，每人服5×10⁶cfuO139产毒株，6名对照中有5名发生霍乱样腹泻，7名服苗者中只有1人发生轻度腹泻。该菌苗保护率为83%，该菌苗为动力缺失株，但动力缺失未减低菌苗的定居能力和免疫原性。

Tackete等^[16]研制出CVD112，给12名志愿者服用菌苗10⁶-10⁸cfu，6名服10⁶cfu者均无腹泻和其他明显的症状，6名10⁸cfu者中有3名轻度腹泻。服苗后1个月，12名服苗者中11名血清抗毒抗体阳性，11名外周血抗体分泌细胞（ASC）分泌针对肠毒素、脂多糖和荚膜多糖的IgA抗体，但12名血清杀弧菌抗体均为阴性。分析认为可能是O139的荚膜多遮住了脂多糖，影响了针对脂多糖的杀弧菌试验。服苗后5周，对8名服苗者进行攻击试验，以15名未服苗者作对照，每人服10⁸cfuO139产毒株，15名对照中有12名发生霍乱样腹泻，8名服苗者中只有1人发生轻度腹<