摘要 本文介绍了同工酶电泳、免疫学方法、DNA-DNA杂交、酶切片段分析及序列测定等技术运用于利什曼原虫分子分类的研究进展。

关键词 利什曼原虫 dNA 分类

利什曼原虫不同各亚种引起不同类型的利什曼病，它们有不同的流行病学特征。利什曼原虫种株的分析和鉴定对于提高临床疗效、控制此病的流行有重要意义。利什曼原虫的分子分析方法，以蛋白质、染色体、核酸为材料，运用同工酶电泳、免疫学方法、DNA-DNA杂交、酶切片段分析及序列测定等技术，揭示利什曼原虫种株基因结构，系统发育关系以及基因鉴别标志，从生命本质上揭示利什曼原虫种株之间的系谱关系。现就这方面的研究综述如下。

1 动基体DNA与利什曼原虫分类的研究

动基体DNA（kDNA）是动基体目原虫所特有的一种线粒体DNA，它由大小不同的两种环状结构的DNA分子组成，分别称为大环（maxicircle）kDNA和微环（minicircle）kDNA。微环kDNA大约1 kb，有短的保守区和长的变异区。比较不同利什曼虫的微环序列，见有大约200 bp序列，在种与亚种之间存在序列的变异。Rodgers^[1]据上述kDNA微环序列特征，设计PCR引物13A和13B，以PCR扩增墨西哥利什曼原虫和巴西利什曼原虫DNA。分别用上述利什曼原虫扩增kDNA微环片段作为探针，进行DNA-DNA杂交，能敏感、特异区分这两种利什曼原虫。作者采用上述同样引物，以PCR扩增新疆皮肤利什曼病原体及有关虫种，皆获120 bpkDNA微环保守区的特异片段，进行单链构象多态性分析，新疆皮肤利什曼病病原体kDNA120 bp片段ssDNA迁移率皆异于热带利什曼原虫和婴儿利什曼原虫^[2]。

2 rRNA基因

Guevan(1992)^[3]用L.garnhami和巴西利什曼原虫的核糖体非转录区（NTS）作为探针，对新世界的不同利什曼原虫种株进行杂交分析。在高度严谨条件下，L.garnhami探针具有种特异性，而在中度严谨条件下，对墨西哥利什曼原虫种团有特异性。巴西利什曼原虫探针具有种团（complex）的特异性，Guevan利用NTS序列的高度特异性，鉴定墨西哥利什曼原虫和巴西利什曼原虫种团，效果较好。

3 小亚基核糖体

小亚基核糖体（small subunit rRNA,SSUrRNA）原核生物为16S rRNA，真核生物为18S rRNA。因它含有大量的可供统计运算的高度保守和部分保守的基因碱基序列，已用来计算发育的进化距离，构建进化树及利什曼原虫种株的鉴定。

Uliana用限制性内切酶PVU Ⅱ酶切位点，合成一个包含PVUⅡ酶切位点R 20个碱基的寡核苷酸，这段序列作为探针可检测10³个前鞭毛。该探针可与所有利什曼原虫种株进行杂交。而不与枯氏锥虫发生杂交，具有属特异性，可直接用于临床和流行区的现场检测利什曼原虫。

van Eys等（1992）分析9株利什曼原虫的SSU rRNA基因序列800 bp的片段，并与已发表的杜氏利什曼原虫、布氏锥虫、克氏锥虫和Crithidia fasciculata 的SSU rRNA基因的中心部分含有两个互不同源的独特的序列（UQ-Ⅰ及UQ-Ⅱ）。比较分析利什曼原虫及其它锥虫料的SSU rRNA基因中心序列不同点，它们分别位于UQ-Ⅰ和UQ-Ⅱ两个序列内，而9种利什曼原虫SSU rRNA基因序列几乎完全同源。但在UQ-Ⅰ处有7个点突变，UQ-Ⅱ处有2个点突变。依据利什曼原虫的特异序列，设计特异的引物，行PCR扩增，观察点突变，鉴定利什曼原虫^[4]。

4 rRNA基因系统发育重建

建立一个符合客观自然进化和亲缘关系的分类体系，是生物学家长期以来不断探索研究的课题。进化树或系统树（phylogenetic tree）的构建，由物种进化树发展为分子进化树，这是一个漫长的研究发展过程。分子分类学中提出系统发生重建，就是构建以分子数据为基础的分子进化树，它可以精确地反应物种间和群体间在进化过程中发生的极微细的遗传变异（小至一个氨基酸或一个核苷酸的差异）。依据利什曼原虫蛋白质或核酸分子序列结构的比较分析，系统树能反映利什曼原虫种的自然演化系统分类体系。

Fernandes等（1993）^[5]根据文献报道的布氏锥虫、杜氏利什曼原虫和Grithidia fasciculata的保守区序列，设计PCR的引物，PCR扩增B.caudatus、克氏锥虫、Endotrypanum monterogei、Leptomonas sp、硕大利什曼原虫、杜氏利什曼原虫和Blastocrithidia culicis的rRNA基因，所获片段克隆于M13载体，进行序列测定分析，并与文献报道有关序列相比较。序列分析后发现，B.caudats、克氏锥虫、E.monterogei、Lepomonas sp和杜氏利什曼原虫种株之间rRNA序列存在较大异源性。克氏锥虫种之间rRNA序列相对较为接近。借助LSU rRNA和SSU rRNA基因序列比较分析，用Sogin's结构类似法测定计算所比较的序列的距离，用PAUP程序简并法计算构建系统树，通过自展法分析系统发育树。结果显示：Leishmania,Endotrypanum,Crithidia,Leptomanas的基因距离是类似的，在系统发育树上属于一个组，这一组的原生动物与布氏锥虫和克氏锥虫，Bodo euglena逐渐降低类似性。借助大小亚基RNA序列分析所建的系统树，结果一致。

高度保守的rRNA基因应用于锥虫科距离系统发育的研究，有应用价值。真核生物串联的rRNA基因被非转录空间（NTS）所分隔。在进化上，NTS比编码成熟的rRNA基因区的进化速度为快。鉴于上述特征，NTS已应用于相对接近生物种类的分析，亦包括利什曼原虫种类。在转录区的编码rRNA基因（internal transcribed sequences,ITS）有相当大的可变性。利什曼原虫的ITS比NTS要小，约为1 kb。可用ITS高度保守区的片段设计PCR引物，进行种株分析^[6-9]。

Cupolillo等（1995）用PCR放大位于5.8rRNA相隔的大小亚基之间的rRNA基因ITS，用10种不同限制性内切酶消化扩增片段，分析50种不同地区的Viannia种株，分析序列的差异，构建进化树。在Viannia亚属内，可见一些种类（L.equatorensis,L.panmensis,L.guyanensis,L.shawi）形成高聚类，巴西利什曼原虫L.naiffi呈现高度的多型性。而L.naiffi距离线相对最大，L.colombiensis, l.equatorensis, L.lainsoni 呈现等同分支线。上述结果与用同工酶及微小外显子序列比较构建的进化树的结果分析一致^[10]。

5 微小外显子基因

动基体目的原生动物的微小外显子基因（mini-exongene）,在核基因占有100-200个重复的拷贝，每一重复拷贝由转录区及非转录区所组成，转录区含有高度保守的39个核苷酸碱基的外显子及中度保守的约55-101个核苷酸碱基（依种类而定）内含子所构成。转录区产生一个短小RNA分子称med rNA或SLRNA。外显子转录剪接到所有核的mRNAs 5'端。微小外显子基因的非转录区，可用于动基体目原生物接近种类的鉴定。Fernandes等（1994）用PCR扩增旧世界及新世界利什曼原虫微小外显子，克隆后进行序列测定，观察其变化特征。Fernandes共克隆及测定了18个不同利什曼种的微小外显序列，比较分析微小外显子序列后，产生四个主要聚类，1）全部内脏利什曼（VL）种类；2）旧世界（DL）种类；3）新世界的DL种类；4）新世界Viannia dL种、亚种类。上述分析符合已有的生物学分类参数^[7]。

6 分子核型分析

脉冲场电泳是一种很有效的分离染色体DNA的技术。Scholler(1986)报道脉冲场电泳显示新世界利什曼原虫三个种及亚种的DBA核型明显不同，在相对接近虫株内，分子核型有较多的类似性。即使株之间，发现两类染色体DNA也明显不同，DNA差异为50 kb左右，总计染色带数为14-24条，依株而定^[11]。Bishop（1987）及脉冲场电泳不同的杜氏利什曼原虫分离株，发现全部杜氏利什曼原虫株有22条染色体，染色体大小在270-4000 kb之间，株间存在染色体大小的多态性^[12]。Hamekamp(1991)报道9种利什曼原虫脉冲场电泳染色体条带明显不同：杜氏利什曼原虫24条，L.athiopica21条，热带利什曼原虫23条，L.guyanensis 22条，巴西利什曼原虫23条，豚鼠利什曼原虫20条^[13]。

7 随机扩增的多态性DNA（Random amplifide polymorlic DNA.RAPD）

RAPD-PCR法在利什曼原虫种株鉴定方面已有报道。Noyes等（1996）用RAPD鉴定L.uiannia，巴西利什曼原虫及L.panamensis。初筛28个随机引物，PCR扩增出5条以上片段的指纹图型，能够区分亚种。用引物3301和M13鉴定巴西利什曼原虫和L.panamensis;引物3301扩增出巴西利什曼原虫所独有的1500 bp片段，引物M13扩增出L.panamensis所独有的2 200 bp片段。RAPD研究结果与其它同工酶的鉴定相一致^[14]。

8 利什曼原虫分类的同工酶研究

以同工酶作分类研究是依据不同等位基因或位点基因型频率变化，分析酶电泳图型，从最初直观性酶谱比较，发展到与计算机技术结合而形成的同工酶谱数值分类学（numerical taxonomy）。 Cuploillo等^[15]用18种同工酶分析251株利什曼原虫，并与19株利什曼种株标准株相比较，用聚类多元统计分析和表型分析等方法，分析酶电泳