摘要本实验对双氢青蒿素治疗小鼠急性弓形虫感染的疗效进行了进一步考察。小鼠腹腔内感染RH株弓形虫速殖子2×10³，8h后给予单独双氢青蒿素75mg/kg·d和双氢青蒿素75mg/kg·d联合磺胺嘧啶钠100mg/kg·d灌喂小鼠治疗，每日2次，疗程15天，观察小鼠存活率，并于感染后第9、15、31天取小鼠腹水及肝脏进行虫体PCR检测。双氢青蒿素联合磺胺嘧啶钠组小鼠存活率达93%，与单独磺胺嘧啶钠(200 mg/kg·d)组存活率(69.3%)及单独双氢青蒿素(75 mg/kg·d)组存活率(0%)都有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)。PCR检测可见小鼠腹水或腹腔冲洗液中除联合治疗组外，其余各组均可检测出虫体DNA，但只有对照组和单独双氢青蒿素组小鼠的肝脏中可检测出虫体DNA。结论(1)双氢青蒿素联合磺胺嘧啶钠以上述方式治疗小鼠急性弓形虫感染产生了协同作用，比两药单独治疗对小鼠的保护作用更好，能更快地清除腹腔中的弓形虫，并更有效地防止停药后的复发。(2)单独双氢青蒿素采用以上方案疗效不理想，只能延长小鼠存活时间。(3)以上各种治疗方案除单独双氢青蒿素组外，都可较好地清除小鼠肝脏中的虫体。(4)本研究为双氢青蒿素临床治疗急性弓形虫感染提供了更具体、合理、有效的用药方案。

FURTHER EVALUATION OF THE EFFECT OF DIHYDROARTEMISININE

ON THE TREATMENT OF ACUTE TOXOPLASMA INFECTION IN MICE

Yan Li

(Beijing Tropical Medicine Reseach Institute,Beijing100050)

Gan Shaobo

(Beijing Tropical Medicine Reseach Institute,Beijing100050)

Qi Zhiqun

(Beijing Tropical Medicine Reseach Institute,Beijing100050)

Li Shuang

(Beijing Tropical Medicine Reseach Institute,Beijing100050)

AbstractObjectiveThe efficacy of dihydroartemisinine was further evaluated in a murine model of acute toxoplasmosis. MethodsMice were challenged intraperitoneally with 2×10³ RH strain tachyzoites of T. gondii. Eight hours later mice were treated with dihydroartemisinine alone (75mg/kg·d) or combined with sulfadiazine (100mg/kg·d) for 15 days,and every 12 hours drugs were administrated orally to mice. Then mice were killed at 9,15,31 days after infection, and the peritoneal fluids and livers were taken out for PCR analysis of DNA of T.gondii. ResultsDihydroartemisinine in combination with sulfadiazine protected 93% mice against death. There was a significant difference between the survival rate of combination regimens and that of sulfadiazine alone (P＜0.05). So did the survival rate between the combination rgimen and dihydroartemisinine alone (P＜0.01). The PCR results indicated that the DNA of T.gondii was detected in peritoneal fluid of mice in all other groups except the dihydroartemisinine combined with sulfadiazine group,but PCR were positive only in livers of mice in control group and dihydroartemisnine group. Conclusion1.The combination of dihydroartemisinine with sulfadiazine protected mice more effectively showing produced the synergistic effect. This regiment cleared the T.gondii in mice more quickly than that using each drug alone,and prevented mice from relapsing of toxoplasmosis more effectively. 2.We were not satisfied with the effectiveness of dihydroartemisnine alone in the treatment of murine toxoplasmosis,since it could only prolong the life time of mice. 3. All therapeutic protocols except the dihydroartemisinine alone cleared T.gondii in livers of mice infected. 4.This study provides a more useful and reasonable protocol with dihydroartemisinine for treatment the acute toxoplasmosis in clinic.

Key wordsToxoplasma gondiiDihydroartemisinineDrug treatmentPCR

弓形虫病(Toxoplasmosis)是由专性细胞内寄生的刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)引起的一种机会致病原虫病，是导致各种免疫功能低下病人死亡及造成孕妇流产、死胎、畸胎的重要原因之一，对人民的健康甚至生命造成威胁，如何更好地防治弓形虫病已成为众多学者研究的课题。

目前最常采用乙胺嘧啶和磺胺嘧啶联合治疗的方法，其毒副反应发生率高达40%，还存在着用量大、疗程长、停药后易复发等缺点(Haverkos,1987)。近年来人们发现了许多具有抗弓形虫作用的新药(Georgiev,1994)，青蒿素类药物就是其中的一种，体内外实验均证实了该类药物的抗弓形虫作用并对其机理进行了探讨(欧阳，1991)(孙志伟，1995)(李爽，1998)。双氢青蒿素在抗疟治疗中表现出高效、低毒、低复燃率、口服方便等优点，本实验选用了双氢青蒿素单独及联合磺胺嘧啶钠治疗急性弓形虫感染小鼠，进一步观察和探讨了双氢青蒿素治疗急性弓形虫病的应用价值。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1虫株：采用国际标准强毒株RH株弓形虫速殖子，虫株在本所以小鼠腹腔传代方式保存。

1.1.2小鼠：采用远交系雌性昆明小鼠，体重18～22g。购自中国医科院动物繁育所。

1.1.3药物：双氢青蒿素片剂(用时研磨成粉状)，由北京科泰新公司生产，批号：010498。磺胺嘧啶钠注射液由湖南制药厂生产，批号：970401-3。生理盐水由石家庄四药股份有限公司生产，批号：97081506。

1.1.4引物：参照文献设计引物(Burg,1989)，该引物来自弓形虫B1基因，由美国CyberSyn公司合成(经RPC纯化)，扩增片段长度194bp。

引物1：5′GGAACTGCATCCGTTCATGAG3′(694～714bp)

引物2：5′TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC3′(887～868bp)

1.1.5PCR扩增系统：TaqDNA聚合酶及10×扩增缓冲液购自美国Promega公司；dNTP购自军事医学科学院(进口产品分装)；PCR扩增仪为美国PE Cetus公司生产的PE480型扩增仪。

1.1.6分子量标准及其它试剂：PBR322/HaeⅢ酶切、琼脂糖购自华美公司；蛋白酶K由Merck公司生产。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立：取RH株弓形虫速殖子腹腔感染48h的小鼠腹水，无菌条件下以生理盐水稀释至5×10³/mL，每只小鼠腹腔内注射0.4mL，相当于2×10³个速殖子。

1.2.2药物治疗方案：

1.2.2.1将实验小鼠随机分为4组，(1)对照组15只；(2)双氢青蒿素单独治疗组17只；(3)磺胺嘧啶钠单独治疗组13只；(4)双氢青蒿素与磺胺嘧啶钠联合治疗组15只。

1.2.2.2药物剂量：根据预实验结果，单独双氢青蒿素组剂量选取75mg/kg^．d，首剂加倍；磺胺嘧啶钠用量单独治疗组为200mg/kg^．d；联合治疗组剂量分别为磺胺嘧啶钠100mg/kg^．d，双氢青蒿素75mg/kg^．d(首剂加倍)。

1.2.2.3给药方法：治疗开始于感染后8h，每12h灌喂1次，定时给药，疗程15天。观察至感染后第30天。

1.2.3PCR检测：

1.2.3.1取材：分别在对照组全部死亡时(感染后第9天)，疗程结束时(感染后第15天)，观察结束时(感染后第31天)，从各组小鼠中选取1只脱椎处死，取其腹水或腹腔冲洗液及肝脏进行弓形虫的PCR检测。

1.2.3.2DNA提取：(1)腹水或腹腔冲洗液以6 000r/min离心5min，弃上清，沉淀悬浮于裂解液中(10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,0.1mol/L NaCl,0.5% SDS,0.4mg/mL蛋白酶K)，55℃水浴消化3h，置100℃煮沸10min，冷却至4℃；(2)取1g肝脏组织加入少量STE缓冲液，在乳钵中制成匀浆，加上述裂解液，使蛋白酶浓度达0.8mg/mL，55℃水浴消化3h，37℃过夜；按常规酚∶氯仿∶异戊醇法提取DNA，并用少量TE溶解DNA，分装后-20℃冻存备用。

1.2.3.3PCR扩增系统：10×扩增缓冲液(50mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.01% Tritons-100) 5μL; 25mmol/L氯化镁(2.0mmol/L)4μL;dNTP(200mmol/L) 4μL;引物1，2(1μmol/L)各1μL；TaqDNA酶(1.25μ)0.25μL；模板DNA 0.5～1μL。用灭菌双蒸水补足50μL反应终体积，以50μL灭菌液体石蜡封顶，瞬时离心混匀，并设阴性对照。

1.2.3.4PCR反应条件：预变性94℃，3min；三温循环94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；末延伸72℃ 5min。

1.2.3.5产物分析：采用琼脂糖凝胶电泳，制备2%含0.5μg/mL溴乙锭的凝胶，水平槽电泳，取10μL扩增产物及2μL 6×加样缓冲液点样，1×TAE缓冲液中电泳，80V，55mA约40min后紫外光(λ=254nm)下观察结