摘要探讨间接法原位PCR在弓形虫感染病原学检测中的应用。以RH株弓形虫速殖子感染小鼠后第2、4、6天处死，取肝脏制备石蜡标本及冰冻切片标本，以间接法原位PCR扩增并检测石蜡标本中的弓形虫DNA，与原位杂交方法检测冰冻切片标本的结果比较。以间接原位PCR方法检测18例标本均得到阳性信号，病原体检出率为100%，优于原位杂交法(9/18)。间接法原位PCR为弓形虫病的病理检测提供了一种可行的新方法。

DETECTION OF TOXOPLASMA INFECTION BY INDIRECT

IN SITU PCR IN MICE LIVER EXPERIMENTALLY

INFECTED WITH TOXOPLASMA GONDII

Li Shuang

（Beijing Tropical Medicine Research Institute 100050）

Gan Shaobo

（Beijing Tropical Medicine Research Institute 100050）

Peng Ruiyun

（Beijing Institute of Radiation Medicine 100850）

Gao Yabing

（Beijing Institute of Radiation Medicine 100850）

Xiong Chengqi

（Beijing Institute of Radiation Medicine 100850）

AbstractThe possible application of the indirect in situ PCR technique or detection of Toxoplasma infection in liver sections of experimentally infected mice was studied. Mice inoculated with Toxoplasma gondii tachyzoites (RH strain) were sacrificed 2,4,6 days after infection Paraffin and frozen sections of the liver were prepared. The indirect in situ PCR was employed to amplify and detect the specific parasite DNA with the paraffin sections. The in situ hybridization technique using frozen sections was parallelly compared. Specific T.Gondii DNA was demonstrated in all the 18 paraffin sections using the indirect in situ PCR; while only half of the frozen (9/18) showed positive by the in situ hybridization technique. The indirect in situ PCR technique may provide a feasible new tool pathological detection of Toxoplasma DNA using normal paraffin sections.

Key words Toxoplasma gondiiPathological detectionIndirect in situ PCR

近年来，弓形虫病的实验室诊断方法除血清学检测及动物接种外，亦有采用PCR方法(陈晓光，1996)及核酸原位杂交方法(吴少庭，刘翠梅，1998)的报道。原位PCR方法因其可将PCR的高效扩增与原位杂交的细胞定位相结合而日益受到研究者的重视。(苏慧慈，1995)本研究将间接原位PCR方法应用于感染小鼠肝脏标本中弓形虫DNA的检测，以期能使之成为一种弓形虫病病理检测的新方法。

1材料与方法

1.1动物模型

以RH株弓形虫(本所保存)感染体重18～22g的雌性昆明小鼠(购自中国医学科学院动物繁育所)。每鼠腹腔接种弓形虫速殖子2×10²个。

1.2待测标本

将感染小鼠以6只1组随机分为3组，于接种后第2、4、6天任选1组处死，取每只小鼠的肝脏，部分固定于10%缓冲福尔马林中，部分存入液氮。以同批未感染小鼠4只做为对照。固定后的组织制备成石蜡切片，厚度7μm，承载蜡片的载玻片需先涂布0.5mg/mL的多聚赖氨酸，并将切片置58℃烤箱内烤3～5天后存于4℃备用。每份标本做常规HE染色。

1.3间接法原位PCR

1.3.1引物及试剂：根据文献(Brezin,1990)设计特异性扩增弓形虫B1基因的1对引物。引物1的碱基序列为：5′-GGA ACT GCA TCC GTT CAT GAG-3′，引物2的碱基序列为：5′-TCT TTA AAG CGT TCG TGG TC-3′，由美国Cybersyn公司合成(经OPC纯化)扩增产物片段长度为194bp。TaqDNA聚合酶购自Promega公司，4种三磷酸核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)购自军事医学科学院(进口产品分装)，蛋白酶K为Merck公司产品，牛血清白蛋白(BSA)为中国科学院上海生物化学研究所产品，ABC检测试剂盒为美国VECTOR LABORATORIES，Inc.公司产品，DAB检测试剂盒及DNA杂交液购自北京中山生物技术有限公司。

1.3.2探针：根据文献(Brezin,1990)选择弓形虫B1基因中853至831位碱基，合成与之互补的寡核苷酸探针，并在5′端标记生物素(Biotin)。探针碱基序列如下：5′-GGC GAC CAA TCT GCG AAT ACA CC-3′。探针合成及标记由军事医学科学院生化室完成。

1.3.3仪器：实验所用的原位PCR扩增仪为美国PE Cetus公司生产的PE1 000型原位PCR扩增仪。

1.3.4标本预处理：取存于4℃的感染小鼠肝脏及正常小鼠肝脏石腊切片标本常规脱蜡、水化，经稀盐酸(0.2N HCL)酸化处理。以蛋白酶K(0.1mol/L Tris-HCL,pH8.0，50mmol/L EDTA，pH8.0配制，工作浓度为50μg/mL)于37℃消化15min。以0.2%的甘氨酸终止反应后经乙醇逐级脱水，风干备用。洗涤液为TBS。

1.3.5原位扩增：预处理后的标本置于PE公司生产的与原位扩增仪配套的专用封片机上，在热启动(94℃)条件下滴加PCR扩增反应液，封片后在PE1 000原位扩增仪上扩增。反应的总体积为50μL，含有10mmol/L Tris-HCL(pH9.0，25℃)、50mmol/L KCl、0.1%TritonX-100、2.5mmol/L MgCl₂、BSA 3μg/mL、Taq酶4U、4种三磷酸核苷酸各200μmol/L、引物各1μmol/L。反应参数为：94℃变性7min，三温循环为94℃ 2min,60℃ 2min，72℃ 3min。循环次数为30次，末次延伸为72℃ 7min。

1.3.6扩增后原位杂交：原位扩增后经充分洗涤，并经无水乙醇后固定。风干后以不含探针的杂交液孵育，再滴加含2.5μg/mL生物素标记探针的杂交液，100℃变性后置37℃杂交过夜。杂交后经高严格度条件(低盐、高温、含甲酰胺)漂洗并充分洗涤，即可对杂交体进行检测(苏慧慈，1994)。

1.3.7杂交体检测：检测采用ABC复合物检测系统，先经3%H₂O₂破坏内源性过氧化物酶并用正常血清封闭，按试剂盒说明滴加ABC复合物并用DAB系统显色(暗盒内4℃过夜)，自来水冲洗终止反应。

1.3.8结果判定：终止显色后以苏木素染液复染，并按常规脱水、透明、封片。镜检阳性结果呈棕黄色。每次试验均设立无Taq酶、无探针及检测系统对照，同时检测正常小鼠肝脏标本为已知阴性对照。

1.4原位杂交检测

以存于液氮中的小鼠肝脏组织制备冰冻切片，厚7μm，以不含探针的DNA杂交液预孵育后，滴加含2.5μg/mL生物素标记的探针的杂交液，杂交温度42℃。杂交后处理同1.3.6及1.3.7。结果判定同1.3.8。

2结果

2.1以间接法原位PCR检测

18只弓形虫感染小鼠的肝脏切片，在感染的3个时相，镜下均呈阳性，虫体DNA检出率为100%。对照均阴性。阴性信号见于肝窦、汇管区、坏死灶等处，背景细胞核为兰色。(图版Ⅰ)

间接法原位PCR检测结果，感染6天后的鼠肝切片,10×100

The result of indirect in situ PCR,10×100

2.2经原位杂交检测

感染后第2、4、6天各组小鼠肝脏标本的阳性检出数分别为2、3、4例，总检出率(9/18)低于间接原位PCR法。

2.3经常规HE染色

感染后第2天小鼠肝脏标本中未见明显异常；感染后第4、6天小鼠肝脏标本中可见到坏死灶；并在5例(第4天)及6例(第6天)标本中见到弓形虫疑似物。

3讨论

原位PCR方法最早见于90年代初(Haase,1990)可根据检测扩增产物时的探针是否带标记物而分为直接法和间接法两大类。目前，间接法原位PCR应用最为广泛，其扩增效率较高，并且因原位杂交所用的探针不会检出扩增产物中的非靶序列成分，因而特异性较强。

原位PCR操作步骤较多，在实验室内成功地建立该法需在标本制备、预处理、原位扩增及后处理、原位检测等各环节加以注意。本实验采用10%缓冲福尔马林为固定剂，室温放置达1周以上仍可得到较好的结果：取切片厚度为7μm，在保证背景较低及良好的可分辨细胞形态的同时，也保证了一定量的待测核酸模板量；为防止操作过程中标本脱落，载片上加涂了0.5mg/mL的多聚赖氨酸。

对于标本的预处理是原位PCR中必不可少的步骤，组织标本经蛋白酶消化后可增加通透性，使反应试剂进入细胞内，并暴露靶核酸序列。消化不足可导致细胞通透性差，蛋白质与核酸之间广泛交联，出现假阴性结果，而过渡消化则可<