摘要为了在分子水平上研究拟除虫菊酯抗性家蝇的P450基因的特性，更好地研究其与抗性相关的机制，本研究根据在美洲地区的抗性家蝇品系(LPR)克隆的P450基因MDC YP6D1的保守序列设计合成引物，用PCR方法从北京地区的家蝇中也扩增出1条约210 bp的特异性片段，片段长度与原序列对应片段相近，说明北京地区的家蝇P450基因与MDCYP6D1间有很大的同源性。Hinf I酶切发现扩增产物上并没有相应的酶切位点，说明扩增产物与原序列MDCYP6D1的相应部分不一样，提示这一用PCR方法在北京地区的家蝇中扩增出的P450基因片段有可能对应一新的P450基因。PCR-SSCP结果显示扩增产物在一级结构上有一定的多态性，这一现象可能与P450基因在昆虫体内的复杂多样性有关。

PRIMARY STUDIES ON RESISTANCE-RELATED P450 GENE

IN HOUSEFLIES IN BEIJING

Zhu Lihua

(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)

Zhao Tongyan

(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)

Dong Yande

(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)

Yu Hong

(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)

Lu Baolin

(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)

AbstractTo study the molecular characteristics of pyrethroid-resistance related P450 in houseflies,according to P450 gene MDCYP6D1 and MDCYP6A1 cloned from two resistant housefly strains in America,two primers(named P1 and P2)were designed.From both permethrin-resistant housefly strains in Beijing a distinctive fragment can also be obtained using PCR method,which showed that the P450 genes in the two districts are similar.But through HinfI enzyme its variations and differences have been showed.It can be deduced that the similar P450 gene responsible for pyrethroid resistance is also existed in houseflies in Beijing district.But the same gene in the two districts have some differences in their P450 gene structure.The results of PCR-SSCP have showed its polymorphisms in Beijing strains,which also illustrate the complicate characteristics of this P450 gene.

Key words Housefiles Permethrin-resistantPCRHinfISSCP

细胞色素P450是一类结构性质类似的一族蛋白质，是微粒体多功能氧化酶(MFO)系统中的末端氧化酶，在生物体内氧化代谢中起着关键的作用，它与氧分子和底物结合，决定着整个系统的底物专一性，并参与氧的活化。细胞色素P450在昆虫体内的代谢活动中具有重要作用，其中包括杀虫剂代谢、昆虫对杀虫剂的选择毒性和抗药性、保幼激素和蜕皮激素的代谢、以及昆虫对寄生植物的适应性等，昆虫对杀虫剂产生抗药性的主要机制是由于相关的P450基因表达及催化活性发生了变化(冷欣夫等，1996；唐振华，1990a；唐振华，1990b;唐振华，1993；黄俊勇等，1991；翟启慧，1995；Ernest,1983)，因此对P450酶系的研究已成为目前杀虫剂抗性研究领域的一个热点。P450基因超家族现已发现有36个基因家族，包括220多个基因群。在昆虫中现已克隆了16种昆虫的P450基因，分属于CYP6和CYP4家族，其中一些属于CYP6家族的基因已被证实或推测与昆虫抗性有关(Alan,1991)。近几年在家蝇中分别克隆了2种与抗性相关的P450基因的cDNA序列CYP6A1和CYP6D1(Feyereisen et al,1989;Tomita et al,1995)。为了在分子水平上研究北京地区拟除虫菊酯抗性家蝇的P450基因的特性，本研究用PCR等技术对在实验室选育的二氯苯醚菊酯抗性家蝇品系北京株进行研究，探讨家蝇抗性相关P450基因的结构和多态性。

1材料与方法

1.1家蝇Musca domestica Vicina

敏感品系(SS)：为本实验室正常饲养10年以上，没有接触过任何杀虫剂。

二氯苯醚菊酯抗性品系(Pm-R)：采自北京的野外种群，在实验室用二氯苯醚菊酯选育30代以上，抗性倍数达2 000倍以上(未发表资料)。

1.2方法

1.2.1单只家蝇基因组DNA提取(酚-氯仿-异戊醇抽提)：将羽化3～4天的成蝇低温麻醉后，分别加300μL裂解液(10 mmol/L Tris-HCL,50 mmol/L EDTA,1%SDS,50 mmol/L NaCl,0.15 mmol/L精胺，0.5 mmol/L亚精胺，pH8.6)匀浆，再加2.5μL蛋白酶K(40 mg/mL)，50℃水浴过夜，用等体积水饱和酚、氯仿-异戊醇(24∶1)各抽提1次，加2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀2 h，再用400μL冷75%乙醇洗涤，沉淀溶于100μL ddH₂O。

1.2.2引物设计：根据家蝇MDCYP6D1的保守序列设计(Tomita et al.,1995),并参考家蝇P450基因MDCYP6A1的相应序列，扩增片段长度为212 bp。引物P1：GAAACCACCCGCAAATACCC，引物P2：ACAATGCCTTGGACCCTCTCC。京海生物工程公司合成。

1.2.3PCR方法的建立：反应体积25 μL，分别加入2.5 μL 10×PCR缓冲液(0.5 mol/L KCl，0.1 mol/L Tris-HCl,pH8.0，0.15 mol/L MgCl₂，1 mg/mL明胶)，2 μL dNTP(25 mmol/L)，引物P1、P2(25μmol/L)各1μL，DNA模板2 μL，余下用ddH₂O补齐。循环条件：95℃预变性10 min、94℃变性1 min、65℃复性50 s、72℃延伸1 min,30个循环，72℃延伸10 min。

1.2.41%琼脂糖凝胶电泳：75V电压出胶，60V恒压1 h，紫外灯下检测并拍照。

1.2.5PCR产物酶切：内切酶HinfI的酶切位点是G^↓ANTC，反应体积20μL，HinfI酶1μL,37℃反应1h,0.1 mmol/L EDTA终止反应。

1.2.6PCR-SSCP分析：用不对称PCR扩增以获得单链DNA，即将引物Pl少加一半或更多，其它条件同1.2.3。PCR扩增产物与变性上样液(95%甲酰胺，20 mmol/L EDTA,0.05%溴酚蓝，0.05%二甲基蓝)混合(10∶3)，95℃5min，迅速冷冻。然后12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电极液(1×TBE)：0.09 mol/L Tris-硼酸,1mmol/L EDTA(pH8.0)，电泳条件：150伏出胶，120伏恒压5 h。银染：10% 乙酸20 min,H₂O洗2～3次，每次2 min,1.5 g/L AgNO₃ +1.5 ml/LHCOH 30 min,H₂O洗20s,3% Na₂CO₃+0.15%HCOH+2mg/L Na₂S₂O₃ 2～5 min,至显色，可见光下拍照。

2结果

2.1PCR扩增及酶切结果

P450基因MDCYP6D1是从美洲地区拟除虫菊酯抗性家蝇品系(LPR)中克隆的，根据该基因的保守序列设计合成引物，从北京地区的二氯苯醚菊酯抗性家蝇提取基因组DNA，用PCR方法扩增，结果也能扩增出一条特异性片段(图1)，片段长度与原序列对应片段长度相近(212bp)。

图1PCR扩增琼脂糖电泳结果

Fig.11% Agarose Electrophoresis of PCR

1～3.PCR产物；4.DNA分子标记

1～3. PCR results；4. DNA markers (100bp ladders)

分析发现P450基因MDCYP6D1序列上有一限制性内切酶HinfI的位点，用此HinfI酶切扩增产物，发现扩增产物并没有被切开，说明其序列上并没有与原序列上相应的酶切位点。

2.2PCR-SSCP结果

以不对称PCR扩增获得单链PCR扩增产物，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染，进行单链构象多态分析(PCR-SSCP)，结果每个个体都显示出银染条带3～4条，比较发现个体间差异不大，条带的数量和迁移率一样(图2)，说明PCR扩增产物的一级结构上在家蝇个体内有一定的多态性，并不单一，但个体间没有区别。

图2PCR-SSCP结果

Fig.2Resultt of PCR-SSCP.

1～3.抗性株；4～6.敏感株。

1～3. resistant strain；4～6.susceptible strain

3讨论

Cohen(1995)对家蝇的P450基因研究发现在不同的种群中存在不同的同源性。CYP6A1是从家蝇抗性品系Rutgers(地亚农筛选，对有机氯、有机磷和氨基甲酸酯抗性)中克隆的，与敏感家蝇种群sbo中分离的P450基因CYP6A3、CYP6A4、CYP6A5、CYP6A6、CYP6C1和CYP6C2，同源性介于39%～71%之间(Cohen,et al,1995)。本研究发现，根据从美洲地区拟除虫菊酯抗性家蝇品