摘要为获取有效的日本血吸虫病早期诊断靶抗原分子。以感染前和感染后2周、4周、6周兔混合血清以及急性、慢性日本血吸虫病人和正常人血清，用Western blot对日本血吸虫成虫可溶性抗原(AWA)和虫卵可溶性抗原(SEA)进行了全面的分析与筛选。SEA140kDa和AWA54kDa、21kDa、20kDa分子出现最早，能被感染后2周兔血清所识别；SEA69kDa、50kDa、45kDa、38kDa和AWA72kDa、45kDa、34kDa、15kDa相继能被感染后4周兔血清所识别；其中SEA140kDa、50kDa、45kDa、38kDa和AWA34kDa、21kDa、54kDa、15kDa与病人血清反应同6周兔血清反应效果相仿，均为免疫反应主带，且在SDS-PAGE上有对应的蛋白主带，具有潜在的早期诊断价值。进一步对SEA进行抗体类型的分析，发现SEA能刺激机体产生IgG、IgM和IgA反应，其中SEA50kDa、45kDa、38kDa三个抗原分子均能被IgG、IgM、IgA三种抗体所识别，且均为反应主带；SEA140kDa以IgM反应带最深；SEA100 kDa反应带仅出现于病人血清，以IgM反应最强，且其与IgM反应带在急性病人血清明显深于慢性病人血清，表明针对IgM的SEA 100kDa分子也具有一定的早期诊断和区分病程的价值。SEA140kDa、50kDa、45kDa、38kDa和AWA34kDa、21kDa、54kDa、15kDa和针对IgM的SEA100kDa分子是具有潜在早期诊断价值的优势靶抗原分子。

SCREENING OF EARLY DIAGNOSTIC MOLECULES OF

THE SOLUBLE ADULT WORM ANTIGEN (AWA) AND SOLUBLE EGG

ANTIGEN (SEA) OF SCHISTOSOMA JAPONICUM

Zhou Xiaohong

（The First Military Medical University,Guangzhou510515）

Chen Xiaoguang

（The First Military Medical University,Guangzhou510515）

Feng Mingzhao

（Department of Biology,Hongkong Chinese University）

Li Hua

（The First Military Medical University,Guangzhou510515）

Liu Guozhang

（The First Military Medical University,Guangzhou510515）

AbstractIn order to obtain the effective early target antigen molecules of Schistosoma japonicum for immunodiagnosis. The soluble adult worm antigen (AWA) and soluble egg antigen (SEA) of Schistosoma japonicum have been screened and analyzed using Western blot with sera of rabbits before and 2W,4W,6W after infection and sera of acute,chronic Schistosomiasis patients and normal human beings. SEA 140kDa and AWA 54,21,20kDa molecules appeared earliest,and could be recognized by rabbits sera after 2W infection. Reactions to SEA 69,50,45,38kDa and AWA 72,45,34,15kDa antigens appeared 4W post infection. Among these early antigens,SEA 140,50,45,38kDa and AWA 34,21,54,15kDa molecules reacted with both Schistosomiasis patients sera and rabbits sera after 6W infection. These eight antigens caused strong immune response and showed themselves to be main protein bands by SDS-PAGE. It suggested that these eight molecules would be potential early antigens for immunodiagnosis. Further experiments to analysis immunoglobulin type response against SEA revealed that SEA could stimulate body to produce IgG and IgM and IgA antibodies. SEA 50,45,38kDa molecules induced strong IgG and IgM and IgA responses while SEA 140kDa predominantly resulted in IgM respones. Only reacted with patients sera and resulted in predominant IgM response,SEA 100kDa band against IgM of acute Schistosomiasis patients sera was obvious darker than that of chronic Schistosomiasis patients sera. This showed that the anti-IgM-SEA 100kDa antigen might have the potential early immunodiagnostic value. SEA 140,50,45,38kDa and AWA 34,21,54,15kDa and Anti-IgM-SEA 100kDa of Schistosoma japonicum were the potential early diagnostic molecules.

Key words Schistosomiasis japonicumEarly diagnosisSoluble adult worm antigenSoluble egg antigen

血吸虫病对宿主最大的危害来自虫卵所致的肉芽肿病变。日本血吸虫成虫约24d开始产卵，约4周时肝组织内发现虫卵，5周尚未形成虫卵肉芽肿病变，至6周时肝脏形成虫卵结节(施光峰等，1994)。若能在6周前尚未发生严重病变时即进行诊断，早查早治，则能及时地阻断血吸虫病的发生发展，从而达到保护宿主的目的。目前，国内外均有有关血吸虫病早期诊断方面的研究报道，但国内对日本血吸虫尚无系统而深入的早期诊断研究报道。本研究全面分析和筛选了日本血吸虫AWA和SEA，并初步鉴定了SEA的IgG、IgM、IgA三种抗体类型所识别的靶抗原，以期筛选出具有早期诊断价值的优势靶抗原分子，为今后的现场应用打下良好的工作基础。

1材料与方法

1.1动物来源

1.1.1日本血吸虫感染阳性钉螺江苏省血吸虫病防治研究所提供。

1.1.2成年新西兰纯种白兔2kg～3kg/只，第一军医大学动物实验中心提供。

1.2血清来源

1.2.1急性日本血吸虫病人血清、慢性日本血吸虫病人血清湖南医科大学寄生虫学教研室汪世平教授惠赠。

1.2.2正常人血清广州市血液中心提供广东籍义务献血员正常血清，并经血吸虫ELISA试剂盒检测阴性。

1.2.3正常兔血清兔感染前耳静脉采血。

1.2.4感染兔血清兔尾蚴攻击感染后2周、4周自耳静脉采血，6周自颈动脉放血。

1.3主要试剂

1.3.1HRP标记的羊抗人IgG、IgM、IgA和羊抗兔IgG北京天象人生物工程公司提供。

1.3.2Ap标记的羊抗人IgG和羊抗兔IgG美国Promega公司提供。

1.3.3PVDF膜美国Minipore公司提供。

1.4抗原的制备

1.4.1日本血吸虫AWA的制备新西兰白兔10只，以常规方法感染1 000～1 500条日本血吸虫尾蚴，于感染后42d～45d剖杀，采用心脏灌注法收集成虫。新鲜活虫立即用生理盐水漂洗3次后，收集分装置-20℃备用。取出成虫加适量灭菌生理盐水，于匀浆器中冰浴匀浆10min，再超声粉碎15min(output20，强度6，在冰浴条件下)，4℃冷浸48h，4℃ 10 000r/min离心1h，取上清即AWA，分装后-20℃冻存备用。

1.4.2日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的制备新西兰白兔感染同上，SEA制备方法参见汪世平(1995)。

1.5SDS-PAGE和ELIB

参照Ruppel等(1985)方法进行。分离胶采用12%单一浓度胶。对AWA和SEA进行ELIB分析时，所用急慢性日本血吸虫病人血清和正常人血清以及感染前和感染后2周、4周、6周兔血清均为10份混合；加二抗时，HRP标记的羊抗人IgG、IgM、IgA和羊抗兔IgG均以1：200稀释，Ap标记的羊抗人IgG和羊抗兔IgG均以1：5 000稀释；HRP标记的二抗用DAB系统显色，Ap标记的二抗用NBT/BCIP系统显色。

1.6分子量的测定

用英国UVP公司生产的GDS-7500 型凝胶图像分析系统进行。

2结果

2.1AWA和SEA的SDS-PAGE结果(图1)

图1AWA和SEA的SDS-PAGE分析

Fig.1Coomassie brilliant blue R250 staining of AWA and SEA after SDS-PAGE

1.SEA2.4.AWA3.Marker

SEA出现140kDa、84kDa、57kDa、50kDa、46kDa、38kDa、36kDa、30kDa、27kDa、18/17kDa、14kDa、12/11kDa 12条蛋白主带和114kDa、67kDa等多条次带；AWA出现74kDa、67kDa、54/55kDa、45kDa、38kDa、36kDa、34kDa、32kDa、26/28kDa、21kDa、20kDa、19kDa、18kDa、15kDa、13kDa、11kDa 16条主带，还有97kDa等多条次带。

2.2AWA和SEA的ELTB分析(图2、3，表1)

图2SEA的免疫印迹分析

Fig.2Western blot analysis of SEA with infected and normal rabbit sera &

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