摘要采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫云南株(PFD-3/YN)丝氨酸重复抗原基因片段，经基因序列测定后克隆于pWR450-1融合蛋白表达载体，并转化大肠杆菌TG1。在不同菌体浓度及不同剂量IPTG诱导下检测SERA融合蛋白的表达。采用dot-ELISA及Western-blot分析对表达产物进行鉴定，结果显示SERA基因与pWR450-1重组后在大肠杆菌TG1中表达一72kDa的融合蛋白，当工程菌OD₅₉₀值为0.8～1.2时，加入终浓度1mmol/L IPTG进行诱导，表达量较高。dot-ELISA和Western blot分析表明SERA基因表达产物能被抗SERA单克隆抗体所识别。

CLONING AND EXPRESSION IN E.COLI OF THE SERINE-REPEAT

ANTIGEN GENE FRAGMENT FROM PLASMODIUM FALCIPARUM

Xiao Jianhua

（Department of Microbiology，Hengyang Mecical College，Hengyang，Hunnan 421001）

Li Ming

（Institute of Tropical Medicine，The First Military Medical University，Guangzhou 510515）

Bi Huixiang

（Institute of Tropical Medicine，The First Military Medical University，Guangzhou 510515）

Wang Ping

（Institute of Tropical Medicine，The First Military Medical University，Guangzhou 510515）

Li Yingjie

（Institute of Tropical Medicine，The First Military Medical University，Guangzhou 510515）

AbstractThe serine-repeat antigen gene fragment of the Plasmodium falciparum PFD-3/YN (Yunnan,China) was amplified by polymerase chain reaction. After sequencing,the gene fragment was cloned into pWR450-1 vector for expression of fusion protein with β-galactosidase. The recombinant plasmid pWR450-SERA was transformed into the E. cloi TG1 strain.Different concentrations of IPTG were added to different bacteria densities,and the expressions of the β-galactosidase-SERA fusion proteins in E.coli were examined. Dot-ELISA and Western-blot analysis were used to identify the expression products. The results indicated that the recombinant plasmid could be induced to express a 72kDa fusion protein. The fusion protein was expressed at high-level when the bactera density reached OD₅₉₀ 0.8～1.2 and IPTG was added to a final concentration of 1mmol/L. The dot-ELISA and Western-blot analysis indicated that the expressed fusion protein could react specifically with monoclonal antibody against SERA.

Key words Plasmodium falciparumSerine-repeat antigenGene expression

丝氨酸重复抗原(Serine-repeat antigen,SERA 和Serine-repeat protein,SERP)为疟原虫纳虫空泡抗原，主要位于滋养体和裂殖体的纳虫空泡膜(Delplace et al.，1988)。具体功能还不清楚，可能与棒状体复合蛋白结合宿主红细胞膜参与裂殖子入侵红细胞过程相关(Sam-Yellowe,1993)。经大量的免疫学实验研究和检测，证实了该抗原既是疟原虫红内期保护性抗原，又是疟疾诊断抗原(Inselburg et al.,1993;Cruz et al.,1992;Knapp et al.,1993)。该抗原在疟疾疫苗研制和疟疾诊断应用中有一定价值。本文采用PCR技术扩增了恶性疟原虫云南株(PFD-3/YN)SERA基因片段，经基因序列测定后，克隆于表达载体，并在大肠杆菌中进行了表达。

1材料和方法

1.1材料

Taq酶及dNTP为Sigma公司产品；限制性内切酶及T₄ DNA连接酶为Boehringer Mannheim公司产品；表达质粒pWR450-1、大肠杆菌TG1菌株由复旦大学遗传所国家重点实验室提供。其它试剂为Sigma公司或国产产品。抗恶性疟原虫SERA单克隆抗体由美国新罕布什尔Dartmouth医学院Inselburg博士惠赠。

1.2方法

1.2.1红内期恶性疟原虫收集及染色体DNA提取采用蜡烛缸法进行连续体外培养，当原虫率达70%以上时经0.15%皂素溶解红细胞，收集虫体。采用酚抽提法提取恶性疟原虫云南株(PFD-3/YN)染色体DNA。

1.2.2SERA部分基因扩增及基因测序根据Knapp(1989)发表的恶性疟原虫SERA基因序列设计了一对特异性引物，其5’端引物引入了EcoR I酶切点，3’端引物引入了Sal I酶切点。引物序列如下：SERA-P1(2638bp～2649bp)5'-ATGGAATTCTTACAAATTATT-3',SERA-P2(3074bp～3091bp)5'-GGGTCGACTCCCCAAT ATGGACCCCA-3'。该引物扩增的基因片段处于SERA全基因序列的第2638bp～3091bp位置，共453bp，编码151个氨基酸。经PCR方法扩增恶性疟原虫云南株SERA基因片段后，对扩增产物进行纯化，用EcoR I+Sal I双酶切，将酶切片段克隆于测序载体用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。

1.2.3SERA基因在大肠杆菌中的表达将已测序的M13-SERA重组噬菌体RFDNA进行EcoR I+Sal I双酶切，回收SERA基因片段，并与经相同内切酶消化回收的pWR450-1表达载体进行连接。基因和载体摩尔比为5：1，反应体系10μL,12℃水浴连接过夜。取相当于30ng载体的连接液分别转化TG1感受态菌，涂布于LB-Amp(100μg/mL)平板上，37℃培养过夜。从Amp-LB平板上挑取单个菌落进行PCR鉴定及EcoR I+Sal I双酶切鉴定。挑取pWR-SERA重组质粒工程菌单菌落，分别接入Amp-LB培养基中置37℃摇床振摇培养过夜，按1%比例转入新鲜Amp-LB培养基中，37℃摇床培养至OD₅₉₀值达0.6～1.2时，分别用不同浓度(0.1～1 mmol/L)的IPTG诱导培养4h，离心收菌。

1.2.4表达产物的分析

1.2.4.1β-半乳糖苷酶活性测定分别取诱导表达前后的菌液140 μL置Eppendorf管中，5 000r/min离心5min，弃上清，菌体用140μL 0.8% NaCl重悬，加入等体积邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)溶液(0.3% ONPG，0.1% SDS，0.27% β-巯基乙醇，用0.05mol/L PBS配制，pH7.0)，置37℃水浴显色10min,加 80μL 10% Na₂CO₃溶液终止反应，吸取50μL置酶标板中，在分光光度计上测定OD₄₁₅。

1.2.4.2SDS-PAGE取1mL发酵菌液处理后用12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，0.25% 考马斯亮兰R250染色。

1.2.4.3dot-EIISA取发酵菌液50mL，离心弃上清，菌体用STE洗涤，重悬于15mL STE，置冰浴中用Amico超声破碎仪破菌(输出50w，持续时间20s，次数10次)。破菌液经12 000r/min离心15min，留取上清或沉淀做为抗原，进行dot-ELISA。

1.2.4.4Western-blot菌体蛋白经SDS-PAGE后用LKB电泳转移装置将蛋白区带转移至硝酸纤维素膜上进行Western-blot分析。

2结果

2.1SERA基因片段的克隆和鉴定

特异性扩增SERA基因片段，并克隆于测序载体，用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定，证实了该基因为恶性疟原虫SERA基因。将已测序的M13-SERA重组噬菌体RF DNA进行双酶切，回收SERA基因片段克隆于pWR450-1融合蛋白表达载体，转化TG1感受态菌。从Amp-LB平板上挑取单个菌落，进行PCR及双酶切鉴定，阳性重组克隆能扩增出453bp的目的片段，用EcoR I和Sal I双酶切可分离到453bp片段，结果见图1。

图1PCR及双酶切法鉴定pWR-SERA重组质粒

1～2:pWR-SERA重组子；3:pWR450-1质粒；M1:λ DNA/EcoR I+Hind Ⅲ;

5～6:pWR-SERA重组质粒EcoR I+Sal I酶切产物；M2:pGEM-/7zf/Hae Ⅲ DNA;

8～9:pWR-SERA重组质粒PCR扩增产物；10:SERA基因片断。

Fig.1The recombinant plasmids pWR-SERA were identified by PCR

and restriction endonucleases analysi on 1% agarose gel.

2.2重组质粒在大肠杆菌中的表达

挑取pWR-SERA/TG1工程菌单菌落进行扩增，并在不同菌体浓度及不同剂量IPTG诱导下检测SERA融合蛋白的表达，SDS-PAGE发现pWR-SERA/TG1工程菌表达产物在约72kDa处出现一条新的很浓的蛋白区带(图2)，该融合蛋白表达稳定，表达量较高，经GDS-750uvp凝胶光密度图像分析系统检测，SERA融合蛋白占总菌体蛋白的50.28%。其表达的最佳条件为：菌体浓度OD₅₉₀值达0.8～1.2时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导培养4h。

图212% SDS-PAGE检测pWR-SERA重组子在大肠杆菌TG