细胞与分子免疫学杂志2000年第18卷第5期

王宪锋¹,薛采芳¹, 缪 军¹, 刘忠湘¹, 李 珣¹, 甄荣芬¹,穆士杰²

摘 要：目的 建立我国YN株恶性疟原虫(P.f)红内期瞬时转染系统。方法 将含有不同长度片段GBP130启动子的质粒，采用电穿孔法转染入环状体P.f，以液体闪烁计数法检测各质粒中报告基因 cAT的表达。结果 各质粒中启动子的表达强度有差异，转染P.f获得成功。结论 首次建立了我国YN株P.f的瞬时转染系统，为进一步研究P.f的基因表达调控和基因功能奠定了基础。

关键词：恶性疟原虫；转染；瞬时

疟疾是世界性的严重寄生虫病，也是WHO确定应优先控制的流行病之一。由于蚊媒耐药性及疟原虫抗药性的产生和扩散，使以蚊媒控制和药物治疗为中心的疟疾防治手段遇到了挑战。同时，疟原虫生活史的复杂性及其抗原的高变异性，也给疟疾疫苗的研制带来很大困难。因此，控制疟疾必须更深入的研究疟原虫的基础生物学。随着疟疾基因组计划^[1]的进行，许多新发现的基因功能尚不明确，有碍于新药物靶位和保护性抗原的筛选，从而，建立有效的基因转染系统对于阐明新基因的功能显得极为重要。

1 材料和方法

1.1材料 培养的疟原虫为恶性疟原虫（Plasmodium.falciparum，P.f）YN株，由本室保存，参照文献^[2，3]方法进行体外培养和同步化处理。E.coli菌SURE株购自Stratagene公司。Incomplete cytomix(120 mmol/L KCl，0.15 mmol/L CaCl2，2 mmol/L EGTA，5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L K2HPO4/KH2PO4及25 mmol/L Hepes，pH7.6)，10% Saponin/PBS。CAT Enzyme assay System (Promega产品)，1-Deoxy [dichloroacetyl-1-14C] chloramphenicol (Amersham pharmacia Biotech产品)，mixed xylenes (AldRich产品)，其余试剂均为分析纯试剂。GenePulser，Capacitance extender和0.4cm 电转杯为Bio-Rad产品。BL20A全自动高速冷冻离心机为湘西仪器仪表总厂产品，质粒纯化试剂盒QIAGEN tip-500纯化柱为德国QIAGEN公司产品，液体闪烁计数仪LS6500型为美国Beckman公司产品。质粒pGBPCAT，pGBPCATΔ2和pGBPCATΔ3，由德国Heideberg大学Michael Lanzer博士惠赠，报告物氯霉素乙酰转移酶（Chloramphenicol acetyltransferase）基因CAT置于血型糖蛋白结合蛋白130（glycophorin binding protein 130，GBP 130）基因的5’端侧翼序列和组氨酸富集蛋白II（histidine-rich protein II，HRP II）基因的3’ 端侧翼序列控制下进行表达。在3个质粒中GBP130的5’端侧翼序列不同长度的5’片段被删除，具体构建见文献^[4]。以上述质粒分别转化新鲜制备的感受态SURE菌，大量摇菌，按QIAGEN tip-500纯化柱操作指南大量纯化质粒，纯化的质粒的纯度为A260：A280＞1.80。将纯化的质粒用75mL/L酒精洗泡消毒后，溶于TE（pH8.0）使质粒浓度达到1～3g/L。

1.2方法

1.2.1疟原虫的转染 转染时实验分为4组：①加质粒和细胞进行转染；②不加质粒的细胞进行转染；③只有DNA不加细胞进行转染；④加质粒和细胞但不进行转染。

同步化处理的疟原虫，于转染前1个生活周期换液时加入少许新鲜红细胞，推制薄血片，吉氏染色，计算同步化的环状体的感染率。转染前1h培养的疟原虫换液1次，再放入培养箱中。以1500r/min 离心5min。取1～2×109（感染率≥10%）的同步化环状体疟原虫，重新悬于500μL预冷的 incomplete Cytomix溶液中，加入80μg DNA，充分混匀，转入预冷的电转杯，置碎冰中预冷5min后进行电穿孔转染。转染参数设定为2.5 kV，25μF，200Ω。转染后，迅速将电转杯冰浴5min，杯内细胞完全转入培养瓶，加入10 mL 37℃预热的RPMI1640完全培养液和50μL新鲜红细胞。次日和第3日常规换液1次，涂制薄血膜，进行吉氏染色，观察虫体的状态和生活史期。次日换液时，加入50μL新鲜红细胞。

1.2.2细胞抽提物的制备 转染后第4天，取10 mL培养原虫，1000r/min 离心5 min，取沉淀物悬于1mL PBS，转入1.5 mL离心管中，加入10μL10%saponin/PBS，充分混匀，室温静置5 min裂解红细胞后，高速离心3 min，弃上清，分别用1mL PBS 和1mL TEN 各洗1次。沉淀重悬于120μL250 mmol/L的Tris-HCl(pH7.6，含1mmol/L PMSF)，充分混匀。将混悬物于干冰和37℃水浴反复冻融3次裂解原虫，高速离心3 min，取上清转入1.5 mL新鲜离心管，60℃水浴10 min，以15 000g离心2 min，将上清转入新鲜离心管中于-70℃保存备用。

1.2.3 CAT的活性检测于1.5 mL离心管中，按下列组成制备反应混合物：50μL细胞抽提物，3μL14C-chloramphenicol(0.05Ci/L)，5μL n-Butyryl Coenzyme A，加250 mmoL/LTris-HCl (pH8.0)至终体积为125μL。将试剂盒中提供的CAT稀释至2×104U/L作为原液，取5μL用250 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)做1:1，1:2，～1:32系列稀释，代替细胞抽提物，加250 mmoL/L Tris-HCl (pH8.0)至终体积为125μL作为阳性对照。置于37℃水浴。其后的步骤按CAT enzyme Assay System操作说明书进行。同时，在制备反应混合物时不加细胞抽提物，而是以Tris-HCl(pH8.0)补足至125 μL，作为阴性对照。

2 结 果

为得取最佳反应时间，以1×104U/L cAT按上述方法制备7个阳性反应混合物，同时制备7个阴性反应混合物，置于37℃水浴。每2 h取阳性、阴性对照反应混合物各1个，进行活性检测，并做时间梯度分析，对反应的时间进行优化。结果表明，随着反应时间的增加，阳性和阴性对照间的差异总体上呈递增趋势，但在第10 h时有所下降，随后又有上升，至第14 h时达最高（图1）。后续反应时间均以14 h为标准。

图1对照cpm与反应时间的相关性

Fig1 Relationship between control cpm and reactive time

图2 GBP130启动子的删除分析

fig2 Nested deletion analysis of the GBP130 promoter

PC：Positive control； NC：Negative control

为分析GBP130启动子中不同区域对其表达活性的影响，将GBP130启动子不同区域删除，置于报告基因CAT的上游，并以其构建成的质粒pGBPCAT，pGBPCATΔ2和pGBPCATΔ3电转染YN株环状体P.f。48h后，制备细胞抽提物，以液闪计数法检测在原虫内质粒表达的CAT酶。不同GBP130启动子的表达强度以CAT相对活性表示。CAT相对活性= 各样品cpm —阴性对照cpm。

在阳性对照中，随着CAT稀释度的不断增加（从1:1～1:32），CAT的相对活性逐渐降低（图2），表明反应系统具有良好的稳定性。不同GBP130启动子的表达强度呈现出差异性，即pGBPCATΔ2＞ pGBPCAT ＞ pGBPCATΔ3，与Horrocks和Lanzer^[4]分析的结果基本一致，说明转染获得成功，并且P.f的调控序列可能在地理株之间没有差异性。不加质粒的细胞转染组，不加细胞的DNA转染组，以及加质粒和细胞但不进行转染的各实验组，均未检出CAT的表达。

3 讨 论

基因转染是一项非常重要的研究技术，在细胞分子生物学研究领域中，有着不可替代的作用，在哺乳类及其它真核细胞的研究中已经非常成熟。就单细胞微生物而言，细菌和酵母早已转染成功，寄生原虫中的锥虫、利什曼和弓形虫也于10年前相继转染成功，而疟原虫转染研究的进展却非常缓慢^[5]。我们采用电穿孔法，以CAT为报告物，首次瞬时转染我国云南株恶性疟原虫获得成功，并建立了一种有效的疟原虫转染系统，为疟原虫的基因表达调控和基因功能的研究，以及以此为理论依据的我国恶性疟疾的防治奠定了技术基础。

DNA在进入到疟原虫细胞核的过程中，必须经过红细胞膜、含虫空泡膜、疟原虫细胞膜和虫体细胞核膜共4层细胞膜，因而实际进入核内的DNA将可能很少。由于电穿孔法的转染效率与电穿孔时的各种参数有很大关系，因此电穿孔时的各种参数仍有待于进一步优化。本实验中，转染原虫表达CAT的量基本与阳性对照中的1:32稀释度（即3.13×10-3U/μL cAT）接近，如将阳性对照继续稀释，有可能对不同质粒表达的CAT酶进行较为准确的定量。

CAT是细菌中抗药性基因编码的蛋白，在真核细胞中没有该基因，因此在真核细胞中检测其活性时没有酶活性的背景干扰，且对CAT酶活性的检测简便、敏感，为此使CAT基因作为报告基因被广泛地应用于各种真核细胞的转染研究。对CAT的酶活性可通过两种方法进行分析，即液体闪烁计数法（liquid scintillation counting，LSC）和薄层层析法（thin layer chromatography，TLC）。后者相对较为费时，前者则快速、敏感、方便。LSC法中，是将细胞抽提物与含14C或3H标记的氯霉素混合进行孵育，CAT可将辅酶上的丁酰基转移至氯霉素，经二甲苯抽提后，丁酰化的氯霉素主要存在于上层的二甲苯有机相，可用于液闪计数，而未经修饰的氯霉素主要位于下层水相。所有这些操作可在2～3 h内完成，所能检测到的CAT