中国媒介生物学及控制杂志2000年第11卷第2期

王继恒曲传智

关键词：RAPD技术随机扩增多态DNA技术蚊虫

经典的蚊虫研究主要依据蚊虫的各种外部形态特征和生理特征，而这些特征易受各种环境因素的影响。以蚊虫分类为例，经典的分类方法是以形态学为依据^〔1〕，如触角、触须、翅、生殖器等。这些分类依据在大的分类单位内，能清晰地反映一个物种的分类地位；而在小的分类单位，如属、族、种、团内，则很难从形态学上确定蚊虫的分类地位，对于种群、生态型的研究更是无能为力。寻找更精细的分类特征则容易将一些非遗传稳定的性状当作分类特征，而且随着蚊虫生态学、行为学等的研究进展，在同一形态种内有可能发现多个行为种、近缘种。这些问题是形态学力所不及的。随着生物化学技术的不断发展，蛋白质电泳技术在蚊虫遗传变异研究中得以广泛应用。随着研究的深入，发现蛋白质受外界环境条件的影响也很大；同时，能检测出的变异频率不能满足继续深入研究的需要^〔2〕。

现代遗传学表明，物种的遗传性状都是由基因决定的。外部形态的变异及体内蛋白质分子的变化，最本质的原因是由于基因中DNA分子碱基序列发生了改变^〔3〕。因此，从DNA水平着手，物种的遗传和变异及与此有关的一系列问题可望得到解决。随着分子生物学技术的发展，同功酶位点分析技术、DNA探针杂交技术和限制性片段长度多态技术（Restriction fragment Length Polymorphism RFLP)应运而生，但是由于这些技术操作复杂，成本高，限制了它们在蚊虫研究中的应用。近年来，在DNA聚合酶链式反应技术（Polymerase chain Reaction PCR)的基础上发展起来了一种新的DNA水平的检测技术——随机扩增多态性DNA技术（Random amplified Polymorphic DNA RAPD)。该技术简单，容易掌握，周期短，因而得到了迅速发展和广泛应用。目前，已成功地应用于遗传多样性检测、基因定位，品系鉴定、遗传图谱的构建和系统学研究等诸多领域。本文就RAPD技术的特点及其在蚊虫研究中的进展作一综述。

1RAPD技术的原理和特点

RAPD技术是由Williams^〔4〕和Welsh^〔5〕两个研究小组同时发展起来的一项技术。用人工随机合成的10bp左右的短寡核苷酸作为引物，与模板DNA进行PCR反应，这些引物所含的G+C含量一般为50％～70％，在一定的退火条件下能与基因组DNA中互补顺序配对，启动DNA的合成。不同的物种基因组经随机扩增后产生的DNA片段显示不同的指纹图谱，称之为多态性。一旦物种DNA片段有插入、缺失、突变等基因序列改变，所扩增的多态性指纹图谱就会发生相应的变化。虽然单个随机引物检测DNA多态性区域有限，而用几十个甚至几百个引物可对整个基因组进行分析，获得小到单个碱基对变化的丰富信息。若作杂交分析，RAPD带在F1代表现出双亲的谱带，在F2代发生分离，符合孟得尔分离定律，每个随机扩增的多态性片段可以作为遗传图谱的一个位点^〔5〕。

与RFLP和同功酶电泳相比，RAPD技术在蚊虫研究中有其独特的特点和优势。主要表现：（1）RAPD技术简单，容易掌握，在短期内可获得大量的遗传标记，它既克服了同功酶位点偏少的缺点，又避免了RFLP操作技术复杂的弊端，对分离的DNA片段用溴化乙锭染色，直接在紫外灯下观察记录，不必使用印迹法与分子杂交技术；（2）RAPD技术可在没有任何分子遗传背景的情况下，对物种基因组进行DNA多态分析；（3）RAPD技术中可引用的引物种类很多，可对整个基因组进行全面分析，基因组间微小的变异亦可被检测出来。已有专门提供RAPD引物的公司，有条件的实验室亦可根据需要大量合成，大大降低了RAPD技术的成本^〔6〕；（4）RAPD对DNA纯度要求不严格。Barro等^〔7〕证明，用酒精保存的材料或昆虫标本可以用于RAPD分析。国内乔中东等^〔8〕在对硬蜱的RAPD分析中，应用乙醇浸泡、樟脑防腐、冷冻及干燥标本DNA进行扩增，结果无不良影响；（5）RAPD所需材料少，利于对蚊虫这种体积小的昆虫进行基因分析。

在了解RAPD优点的同时，还应注意RAPD技术的缺点：（1）RAPD位点以孟德尔方式遗传，多数位点的标记带表现为显性的特点，不能区分纯合体和杂合体，也就不能提供完整的遗传信息^〔4〕。因此，进行遗传连锁分析要尽可能利用纯系作为材料；（2）RAPD技术扩增产物的稳定性差，这需要通过控制模板DNA和镁离子的浓度及严格保证反应条件来解决，同时只考虑那些重复性好的条带^〔9-10〕；（3）不同实验室之间由于条件的差异，造成了RAPD指纹图谱的重复性较差，因而有人推荐使用标准引物^〔5〕。

2RAPD技术在蚊虫研究中的应用

2.1由于RAPD技术的先进性，因而在蚊虫分子分类中应用最广，Kambhampatic等^〔11〕最先将此技术应用于蚊虫分类。运用两种引物对盾板伊蚊和白纹伊蚊亚组的5种近缘种群进行RAPD分析，两种引物对蚊虫DNA扩增后均能产生大小不等的特异性片段，将两种引物的扩增结果结合使用能正确区分以上蚊种。Favia等^〔12〕用80多种引物对冈比亚按蚊基因组进行分析，扩增出60多种不同的DNA片段，可用于鉴别不同的亚种。同时结合原位杂交，可用于构建细胞学图谱，进行基因连锁分析，标定有用基因等。Wilkerson等^〔13〕用57种引物对非洲疟蚊的两个实验种群（Anopheles gambiae和Anopheles arabiensis）进行扩增，产生出377条DNA带，两种群间有295条带不同。根据清晰度和重复度的标准，筛取13种引物对每种蚊虫的30个个体的DNA进行扩增，其中7种引物扩增出有意义的条带，表明RAPD技术能有效地检测出种群内发生的变异。陈永久等^〔14〕用20种引物，对取自云南省5个地区的25只雌按蚊和4只雄按蚊进行RAPD分析，从使用的20种引物中选择其中扩增谱带清晰的12个引物进行分析，结合UPGMA（Unweighted pair Group Method With Arithmetic Mean）构建的分子系统树，可将29个微小按蚊归并为显著不同的5个组，说明不同地理群体间存在显著的遗传分化。王敏娟等^〔15〕应用3个引物，用RAPD技术对东乡伊蚊、埃及伊蚊和白纹伊蚊的细胞系基因组DNA进行扩增，分别扩增出不同数量和分子大小的多态性图谱；3种伊蚊细胞的基因组DNA扩增产物除有部分相同分子大小的DNA条带外，还有各自独特的DNA条带。

RAPD用于蚊虫种、株生物型种群及个体间鉴别的优越性不容置疑。当前研究多数限于室内分类鉴定，野外流行病学调查运用较少。苏寿祗^〔1〕提出，我国淡色库蚊和致倦库蚊在秦岭以东的分界线是北纬33°，以北是淡色库蚊，以南是致倦库蚊，北纬33°线附近地区为两种蚊混居，这一结论是以形态学为依据的。由于淡色库蚊和致倦库蚊形态上十分相似，所以只能根据两种库蚊明显的形态学差异来确定分界线，对于细小的差异则无能为力，因而不能精确的确定两种库蚊混居和分离的区域。笔者设想，可利用RAPD技术在蚊虫分类中简单、快速、精确的优点，与形态学方法结合起来，去验证这一结论，并确定准确的混居范围和分界线。

2.2RAPD在蚊虫抗药性研究中的应用随着全世界范围内拟除虫菊酯类杀虫剂的广泛应用，媒介抗药性迅速发展，已成为日趋严重的公共卫生问题^〔16〕。抗药性的产生是在杀虫剂施用量不断加大的外界环境条件下，由于突变和选择的作用，与抗药性有关的遗传变异在种群中产生和扩散的结果。普遍认为，媒介的拟除虫菊酯抗性的主要原因，是体内多功能氧化酶中起末端氧化酶作用的细胞色素P450的活性增强^〔17〕。抗性治理的前提在于早期发现抗性和监测抗性的发展。然而，由于从蚊虫体内纯化和鉴定细胞色素P450的技术难度大，故近些年来发展起来的生化测试法和免疫测试法均不能检测拟除虫菊酯抗性^〔18-19〕。RAPD技术用于检测抗性，可使人们在对有关抗性基因缺乏了解的情况下，依赖与抗性基因连锁的DNA多态性标记,对种群的抗性遗传变异进行鉴定。朱昌亮等^〔20〕用RAPD-PCR法,对淡色库蚊抗溴氰菊酯品系和敏感品系的基因组DNA进行了分析鉴别，22个引物在两个品系中各扩增出170条可分辨带，不同引物扩增出的产物数量不等，明显可分辨的带在4～13条之间，绝大部分条带在两品系间是共同的；有7个引物的扩增产物在两者间共显示差异带21条，其中抗性品系特异带12条，敏感品系特异带9条。这些特异片段可为细胞色素P450相关抗性的检测及其它分子生物学研究提供分子标志。由于近年来国内外学者对媒介抗性基因的分子生物学研究多集中于农业昆虫和蝇类，而蚊虫方面研究较少，RAPD由于其技术上的优点，可望在蚊虫抗性研究中深入应用。

综上所述，在短短几年内，RAPD技术已迅速地渗透到蚊虫研究的各个领域。可以预见，随着分子生物学技术的不断发展和完善，RAPD技术将与其它技术相结合，在蚊虫分类和遗传研究、设计蚊虫治理新对策中发挥重要作用。

作者简介：男，1974年出生，1995的毕业于河南医科大学，医师，河南医科大学人体寄生虫学教研室在读研究生作者单位：王继恒（河南医科大学寄生虫学教研室（郑州450052））

曲传智（河南医科大学寄生虫学教研室（郑州450052））

参考文献

1赵慰先.人体寄生虫学.北京：人民卫生出版社，1981.

2Hoy M. A Insect Molecular Genetics.California:Academy Press,1994,3