关键词: 硅微通道；红细胞；变形性；微机械技术

摘要：本文将微机械加工技术引入细胞流变学研究领域，利用集成电路光刻和异向腐蚀工艺，在硅晶体表面形成了亚微米级精度的通道，建立了一种新的硅微通道细胞流变学测量系统，可观察细胞流过微通道的全过程。实验结果表明，系统具有良好的重复性(变异系数CV＜5%)，可灵敏地反映细胞流变特性的改变，可在一定程度上模拟细胞通过毛细血管的行为，并可提供较为丰富的信息。

分类号：R318.01; R331.1^＋41

NEW METHOD FOR MEASUREMENT OF dEFORMABILITY

oF RBCs USING MICROCHANNELS FORMED

iN A SILICON SUBSTRATE

Zheng XiaolinWu NanLu xiaoCai ShaoxiWu YunpengPeng chenglin（Bioengineering Research Institute, Chongqing university, Chongqing 400044）

he LinHu GanyiZheng woCui Maojing（The 24th Institute of The Ministry of Electronic industry, Chongqing 400060）

ABSTRACT：Method and technique of The simulation system of capillary were studied by microchannels formed in a silicon substrate. The design principle and the method were based on the micromechanical technology. The paper presented the manufacturing process of silicon microchannels. The channel grooves were measured at submicrometer accuracy, and formed by the technology of photolithography and etching for integrated circuits. The full process of the flow of cells through the microchannels can be quantitatively observed. The author also studied the reproducibility and application experiment of the method. The experimental results proved that the a new method has a good reproducibility (Coefficient of variation CV＜5%). The new method was is informative, accurate, convenient and economical.

Keywords：Silicon-microchannels; Red blood cells; Deformability; Micromechanical technology▲

0引言

实验方法及理论模型是支撑血液流变学研究的两大支柱。从某种意义上可以说：“细胞力学(特别是红细胞与白细胞力学)的发展史是一部不断完善技术与改进模型的历史^［2］。”

随着血液流变学研究的发展，人们提出了许多测量红细胞变形性的方法并促进了对红细胞变形性的研究。目前应用较为广泛的有微管法和微孔滤膜法以及粘度法^［1～3］。微管法可定量计算单个红细胞的变形性及膜的一些力学参数，但技术要求较高，设备昂贵，测量费时，不宜用于临床检查，限制了它的应用范围。微孔滤膜法的优点是装置较简单，又能在一定程度上模拟红细胞通过微循环中的毛细血管的过程。但不能观察细胞过孔全过程，所得某些结果在各个研究者的报告中存在较大差异，这除了反映出测量红细胞变形性在测量方法上的复杂性外，与滤膜(特别是核孔滤膜)本身性能有较大关系。粘性测量法优点在于一次测量可获得红细胞群体的平均变形性，且操作简便，适用于临床观察。缺点是不能分辨或实测单个细胞或细胞亚群体的变形情况，不能获得物理测量和实际变形之间的定量关系。1992年，Kikuchi等提出了硅微通道毛细血管模型新技术，其测量结果类似于微孔滤膜法，但却改善了测量可靠性并可观察流路^［4］。

作者在吸收国外新技术方法的基础上，开展了硅微通道毛细血管模型及在细胞流变学(红细胞变形性)中的应用研究，建立了一种新的硅微通道细胞流变学测量系统及技术。

1硅微通道的设计

利用硅的特性而建立起的硅微机械加工技术可以制作出尺寸从亚微米到毫微米级的微结构，并有很高的加工精度。

参照国际血液学标准化委员会(ICSH)对微孔滤膜孔径的建议，并考虑硅微机械加工技术中的具体情况，作为初次试验，确定通道的等效直径为6μm。根据目前的工艺条件，若欲获得圆形通道，则难以达到微米精度，且不利于观察。所以将通道横截面形状确定为梯形形状(图1)，按异向腐蚀特性确定上底、下底、高的尺寸分别为9μm、2.6μm、5μm。这样，通道的横截面积为29μm²，和直径为6μm的圆形通道截面积大致相等(28.3μm²)，即通道的等效直径约为6μm。通道长度可根据实验目的确定，本文的工作选择了3种长度，即10μm、30μm及100μm。通道排列密度参照ICSH对微孔滤膜孔密度应在4×10⁵目/cm²的建议值进行设计，取通道排列密度为63条/mm。

图2示出了硅微通道整体结构示意图。边长为10mm的正方形腔体的4条边呈堤坝状，每条边上都加工有许多同一尺寸的微通道。正方形腔体内中央有一个较大的通孔，以使血液试样流入腔内，在腔外侧施加一定负压，则血细胞将经微通道从腔内流至腔外侧。

(a)通道梯形横截面；(b)微通道局部立体结构

图1硅微通道剖面图

图2硅微通道整体结构

2测量系统

在实现硅微通道毛细血管模型的基础上，即可构造测量系统。系统包括三部分：固定硅片的硅片座部分；压力控制及外管路部分；观察、记录、测量及显示部分。

硅片座的作用是固定硅片，形成微通道，并与外流路相连接。图3示出了硅片座的结构。在一定的负压下，细胞被吸入硅片腔内，再经腔四周壁上的微通道出(图3(f))。

由于硅片是不透可见光的，故采用反射式显微镜透过覆盖在硅微通道上方的玻璃片来观察通道情况。图象摄取采用CCD摄象机。

(a)压盖；(b)硅片；(c)玻璃片；

(d)基座；(e)整体结构；(f)细胞流路

图3硅片座结构示意图

3系统流变学检测方法

借鉴核孔滤膜法的检测方法^［6］，作者对该系统建立了较已有类似系统更为简化的细胞力学模型(将在另文中详细介绍)，给出了4类定量评价红细胞变形性的参数指标。

(1)反映单个细胞通过微通道群体效应的参数：

①滤过指数IF

(1)

式中，t_m是一定体积红细胞悬浮液通过微通道的时间，t_s是相同体积对照缓冲液通过时间，H为红细胞压积。

②红细胞通过微通道的阻力系数β

(2)

式中，F_o值是t=0时的细胞悬浮液初始流量，F_s为对照缓冲液流量。

③红细胞通过微通道时的堵塞概率ε

(3)

式中，ΔQ为流量增量，取细胞悬浮液流量F_m和对照缓冲液流量F_s之比值(F_m/F_s)，ΔV为流过体积，ΔP为通道两端的压差，V_c为红细胞体积，R_o为红细胞的流阻。

阻塞概率ε的表达式较为简洁，可利用曲线上多个数据进行最小二乘拟合，容易实现，且可避免用单点数据计算可能带来的较大的误差。

(2)红细胞内液粘度η(近似估算值)

(4)

式中，ΔP恒定不变，为可测量，m为考虑膜粘性等的校正系数。

(3)细胞通过微通道的时间参数

①细胞通过整个通道时间t_p；②细胞从头至尾进入通道入口处所需的时间t_e(当通道较<