关键词: 孕酮；免疫微球；聚苯乙烯；无乳化剂乳液聚合；免疫凝集反应

本研究采用改进的无乳化剂乳液聚合法制备聚苯乙烯微球，并对聚合反应温度和有机溶剂含量对聚合反应和粒径的影响进行了研究；再将合成的聚苯乙烯微球与孕酮抗体反应，结果表明通过加入少量有机溶剂，提高了聚合反应速度和转化率，制备出了粒径可控的单分散聚苯乙烯免疫微球，粒径在200～800nm之间，微球具有较高的抗体结合容量，且结合后保持了较高的抗体活性。用合成的孕酮免疫胶乳进行免疫凝集实验，观察了反应时间，反应温度的影响，确定了免疫反应的基本反应条件。

分类号： R318.08; R169.41

PREPARATION AND EVALUATION OF POLYSTYRENE-PROGESTERONE IMMUNOLOGICALMICROSPHERES

Chang Jin¹, Mao Jinshu¹,Chang Qing², Chen Yirui¹, Zhu Meiguang²

(1 Dept. Polymeric Material Science & Engineering, College of Materials, Tianjin University, Tianjin2 Faculty of Immunology, Tianjin Central Hospital for Gynaecology and Obstetrics, Tianjin)

ABSTRACT:The preparation of the progesterone immunology microspheres consisted of the following steps: Monodispersed polystyrene microspheres which size ranged from 200nm to 800nm were synthesized by emulsifier-free emulsion polymerization. The polymerization rate and yield had been improved by the addition of acetone to the reactant. The effects of the temperature and the acetone concentration on the polymerization and on the properties of the latex were reported. The result of microspheres reacting with anti-progesterone showed that the microspheres had a higher binding capacity. The bological activity of antibody was well remained and aggregation of antiprogesterone-carrying latex particles was studied at different reaction time and temperature.

Key words:Progesterone; Immunological microspheres; Polystyrene; Emulsifier-free emulsion; Polymerization; Immunologic agglutination reaction

0前言

免疫微球(Immunomicrosphere)是70年代后期开始取得较快发展的一项免疫学新技术^［1］。免疫微球要求微球乳液密度高，粒子单分散性好，悬浮性能好，吸附蛋白质的能力强^［2］。聚苯乙烯微球在生物介质中不溶、无毒。由于一般的乳液聚合法，微球粒径分布宽且粒子表面含大量乳化剂，将不利于制备免疫微球。而通过无乳化剂乳液聚合合成的微球悬浮在水中，呈乳白色，粒径单分散性好并呈规则的圆球状，表面“清洁”，不含有残留的乳化剂杂质。因而在生物医学技术领域，用作各种蛋白质或酶的载体。将抗体或抗原通过物理吸附固载于微球表面而形成的免疫胶乳诊断试剂，通过胶乳凝集实验可检测对应的抗原或抗体^［3］。

孕酮是卵巢黄体分泌的类固醇类激素，是妇产科内分泌患者诊断和治疗的一项重要的常规检测，目前我国的孕酮检测方法仅有放射免疫检测(RIA)^［1］。RIA法有下述缺点：操作复杂，需要较精密和贵重的仪器设备，试剂稳定性差，放射性同位素对环境的污染及人体的损害等。因此，本实验致力于非同位素免疫测定方法，即胶乳免疫测定法(LIA)的研究。本研究通过改善苯乙烯的无乳化剂乳液聚合方法，试图提高聚苯乙烯微球制备的反应速率和胶乳固含量，改善粒径的单分散性和胶乳稳定性；并在此基础上将孕酮抗体通过物理吸附方法，固载于胶乳微球表面，形成免疫胶乳诊断试剂。通过胶乳凝集实验^［3］，可检测体液中孕酮的含量，是一种新型的非同位素免疫测定技术。因而在生物医学技术领域，如：免疫诊断试剂和细胞学研究等方面有着广泛的应用^［4］。

1实验部分

1.1材料和仪器

苯乙烯：分析纯，北京福星化工厂。经5% NaOH萃取2次，用蒸馏水洗至中性。

过硫酸钾(KPS)：分析纯，天津东方化工厂。

丙酮：分析纯，天津开发区乐泰化工有限公司。

孕酮抗体(兔)：从ZYMED LABORATORIES，INC.购买。

标准孕酮抗原(系列浓度)：天津市中心妇产医院提供

磷酸缓冲液(PBS)：pH=7.2,浓度1.25mM。

JEM-100 CXⅡ型透射电子显微镜。

1.2实验方法

(1)聚苯乙烯微球制备，致敏及免疫反应

在装有搅拌器，冷凝管，加料器，氮气导气装置的四口瓶中加入去离子水(60g)，丙酮或甲醇(40g)，苯乙烯(10g)，在一定温度下水浴20min，加入KPS(0.15g)，反应8h，所得乳液，经25000rpm超速离心分离，洗涤后，用透射电镜观察。

用pH值7.2的磷酸缓冲液(PBS)将胶乳稀释到一定浓度，搅拌下加入一定量的孕酮抗体溶液，室温下搅拌30min后，于恒温摇床在37℃水浴中孵化1.5h，然后4℃放置5h，经12000rpm高速离心分离，收集上清液，用于紫外测定，沉淀复溶于磷酸缓冲液中，储存于4℃。

在孕酮抗体致敏的聚苯乙烯乳液中加入孕酮抗原，37℃恒温水浴，反应一定时间后，取出上清液，测定吸光度变化。

(2)聚苯乙烯微球的表征

粒径及其分布：用JEM-100 CXⅡ型透射电镜测定粒径，并计算分散系数DP。

转化率：用重量法测定：将2ml聚合物乳液试样放入真空干燥箱，干燥称重后，即可计算得固体含量。

测定抗体吸附量：用紫外光分光光度计测定一定浓度的蛋白质溶液的280nm吸光度值，A1。将反应完毕后收集的上清液，用紫外光分光光度计测定其吸光度值，A2。A1与A2的差值所对应的蛋白质量为吸附于微球表面的蛋白质量，即微球的结合容量。

2结果与讨论

2.1温度对聚合反应的影响

图1是苯乙烯在丙酮-水中无乳化剂乳液聚合的时间-转化率曲线，温度分别为70℃，80℃，90℃。由实验结果可以看出，苯乙烯在丙酮—水体系中进行无乳化剂乳液聚合的聚合速率随温度升高而加快，在90℃时，聚合体系的聚合速率可与乳液聚合的聚合速率相比拟。产生这一现象的原因是苯乙烯在丙酮—水聚合体系中的溶解性随温度的升高而增加^［4］。90℃时苯乙烯在丙酮—水聚合体系中的溶解度是在

图1温度对丙酮—水体系苯乙烯无乳化剂乳液聚合的影响

纯水体系中的15倍，与乙烯基丙烯酸在90℃的溶解度相近， 此时苯乙烯无乳化剂乳液聚合的反应机理类似于亲水性单体进行的无乳化剂乳液聚合，为“均相成核”机理^［5］。单体分子在水相由引发剂引发聚合，链增长速度比较快，当生成的聚合物分子量达到某一临界值时，即从水相中析出，形成初始乳胶粒子。由于这些粒子表面电荷密度比较低，粒子之间静电排斥力不足以使粒子稳定，粒子便相互聚集，直至生成稳定的乳胶粒子；同时乳胶粒子被单体溶胀，进行增长反应。因此可大幅度提高聚合反应速度，使反应时间缩短，而且所得产物固含量大幅度提高。

另一方面丙酮的加入还可以提高引发剂的热分解速率^［6］。过硫酸钾(KPS)在含40%丙酮的体系中的分解速率是在纯水中的3.5倍。由于单体溶解性的增加和引发剂分解速率的增加，加快了作为反应中心的活性乳胶粒的形成，使得聚合体系中活乳胶粒数增加，在其它反应条件不变的情况下，聚合反应速度加快，同时转化率提高。

2.2丙酮含量对聚合反应的影响

在相同温度下丙酮含量对苯乙烯丙酮-水体系无乳化剂乳液聚合反应的转化率的影响，如图2。当丙酮含量低于40%时，聚合反应的转化率随着丙酮含量的增加而提高，当丙酮含量大于50%时，聚合反应的转化率随着丙酮含量的增加而大幅度下降，当丙酮含量大于70%时，此聚合体系下的聚合反应无法得到聚苯乙烯微球。这是由于当丙酮含量低于40%时，随着丙酮含量的增加，单体在水中的溶解度增加，KPS分解速度加快，使反应体系中活性乳胶粒数目增加，使反应速度加快，转化率提高。丙酮含量大于50%时，在反应初形成的粒子，由于单体浓度过高，容易相互聚集，导致反应失败。

丙酮含量(Vol%)

图2丙酮含量对聚苯乙烯转化率的影响

2.3丙酮含量对聚苯乙烯微球粒径的影响

丙酮-水聚合体系中进<