关键词: 碱性磷酸酶(AKP)；生物瓣钙化；坏死细胞

本文在血磷与生物材料钙化关系的研究基础上，从生物瓣材料植入体内后的组织学变化，探讨了AKP与生物瓣钙化的关系。组织学和超微结构研究表明：生物瓣组织在植入体内后有进行性形态学变化，包括形成包囊，刺激组织增生和细胞浸润，包囊诱使细胞变性，细胞在变性中使AKP活力升高，变性和坏死细胞的降解成分便成为钙结晶的成核部位；AKP使局部PO^3-₄积累，促进钙化发生。由此本文探讨了生物瓣钙化中AKP的发生机理和AKP与钙化的关系。

分类号： R318.08

ALKALINE PHOSPHATASE AND CALCIFICATION OFBIOPROSTHETIC VALVE TISSUE (Ⅱ)RELATIONSHIP BETWEEN AKP AND TISSUE CALCIFICATION

Wan Changxiu, Liu Xia, Yue Yilun

(Institute of Biomaterials and Biotechology, Department of Polymer

Science and Materials, Sichuan Union University, Chengdu 610065)

ABSTRACT：On the basis of the previous article, the relationship of AKP and calcification of prosthetic valve tissues was investiged from the histological changes of the subcutaneous implantation of tanned xenograft in wistar rats. Histological and ultrastructural studies demonstrated that the implanted tissues underwent progressively morphological changes, including formation of capsule; cell in filtration and tissue hyperplasia, cell degeneration induced by capsule; AKP activity increase due to cell degeneration or necrosis; the formation of nuclei of calcification at the site of cell degradation, and local accumulatiom of PO^3-₄. due to AKP activity increase with promotion of calcification. Besides, the mechanism of induction of AKP activity, and the relation of AKP to calcification were also discussed.

Key words:Alkaline phosphatase; Bioprosthetic valve tissue; Calcification; Necrotic cell

1材料和方法

1.1材料

实验所用动物、材料和试剂等与“AKP与生物瓣钙化的研究Ⅰ”完全相同，然后将埋植32天的生物瓣组织进行组织学和电镜观察，以未埋植的生物材料作为对照。

1.2测试

1.2.1组织学观察将埋植的牦牛心包从SD大鼠皮下取出，立即置入10%中性缓冲甲醛溶液中固定，与此同时也将未埋植的牦牛心包材料按同样方法处理。然后按常规程序进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色，最后在光学显微镜下观察，切片厚度均为4μm。观察生物瓣组织结构用的染色方法为Harris苏木素—伊红染色法(HE)；钙化染色方法为von Kossa无机盐染色法；观察AKP活力采用新鲜冰冻组织，作冰冻切片，染色方法为Burstone AKP染色法^［1］。

1.2.2超微结构观察^［2］

透射电镜将牦牛心包置入4%戊二醛缓冲液中固定，然后用1/15 mol/L磷酸缓冲液浸洗，再经pH7.2的含1%四氧化锇的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中固定，用乙醇逐级脱水，包埋液和丙酮混合液渗透，用国产环氧树脂618包埋剂包埋。包埋块用LKB超薄切片机切成600?的超薄切片，再用醋酸铀和柠檬酸铅染色，最后在H600 Hitachi透射电子显微镜下观察其超微结构。

扫描电镜将牦牛心包置入pH7.2的0.2mol/L二甲胂酸盐缓冲液配制的3%戊二醛溶液中，剥去其外表粘连的纤维组织，样品经戊二醛固定2h以上，再经0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗三次，随即在1%四氧化锇中固定2h，再经PBS洗三次，然后按丙酮逐级脱水和醋酸异戊酯进行置换的顺序处理样品。最后用Hitachi临界点干燥仪进行临界点干燥和喷金，于Hitachi S-450扫描电子显微镜下观察。

X射线能谱分析在扫描电子显微镜下进行窗口扫描，加速电压为20KV，能谱收集时间100s，利用X射线的能量对样品进行微区分析，随机选取4个区域，了解钙、磷原子含量的百分比。X射线能谱仪为EDAX SW 9100/60。中 国 生 物 医 学 工 程 学 报

2结果

2.1组织学观察

2.1.1Harris苏木素-伊红染色植入前牦牛心包组织(图1a)主要由胶原纤维组成，组织表面的纤维倾向于平行于表面，浆膜层最致密；纤维层为层状结构；结缔组织层的表面最疏松。植入后生物瓣组织表面(图1b)有大量的纤维细胞增生，这些细胞向胶原纤维内进行浸润，甚至进入纤维层，从细胞形态来看(图1c)，最表面的细胞呈梭形，细胞核着色较深，越近内层，细胞越大，形状变圆，细胞核亦变大，着色较浅。

1牦牛心包HE染色

(a) 植入前生物瓣组织 ×660

(b) 植入后牦牛心包表面有纤维细胞增生及浸润

×660

(c) 植入后心包表面增生的梭形细胞浸入心包纤维层

后变形为圆形×1320

2.1.2钙化染色植入前牦牛心包钙化染色为阴性，植入后首先在细胞浸润的最深处出现钙质沉着斑，区域为纤维层，分布是非均一的，钙质沉着处，组织的裂隙增大(图2)。

2.1.3碱性磷酸酶染色植入前牦牛心包的AKP染色为阴性。植入后表面(图3)呈AKP阳性，组织内部个别部位呈AKP阳性，可能是纤维细胞浸润的结果。

2钙化染色(植入后生物瓣组织)图3碱性磷酸酶染色(植入后生物瓣组织)

×330→钙化斑×330碱性磷酸酶染色呈阳性

2.2超微结构观察

2.2.1透射电镜结果如图4所示。植入前牦牛心包显示三层结构：浆膜层、纤维层、结缔组织层。纤维层仅显示纵横排列的胶原纤维结构(图4a)。植入后纤维层除纵横排列的胶原纤维外，还有钙盐沉着，钙化发生在胶原纤维之间，也发生在胶原纤维内部(图4b)。牦牛心包植入体内后，在其两面有细胞明显增生，而且细胞相同，根据形态，可鉴定为淋巴细胞和纤维细胞(图4c)。进一步还可观察到浸润细胞的细胞膜遭到破坏，细胞器结构不清晰，线粒体内有空泡，粗面内质网明显扩张(图4d)。

2.2.2扫描电镜牦牛心包由表面的浆膜层、纤维中层和底面的结缔组织层构成^［4，5］。

浆膜层表面浆膜层表面的形态结构如图5所示。在植入体内前(图5a)，浆膜层覆盖有一层糖蛋白衣，表面结构不均一，有凹窝；植入体内后，浆膜层的凹隙变浅，几乎平整(图5b)，表面有散在的絮状纤维团聚集(图5c)。

结缔组织层表面结缔组织层表面的结构如图6所示。植入前，结缔组织层表面呈现粗细不均的纤维结构，胶原纤维呈波纹状或直线状，胶原纤维细丝上有絮状物附着(图6a、6b)；埋植后，结缔组织层表面，胶原纤维多呈波纹状，几乎找不着直线状，其形态结构较未植入的组织致密和均匀(图6c)。图6d中可见到胶原纤维上附着一层薄膜般的物质(纤维包囊)，图6e中还可见到这层物质为絮状纤维细丝团组成，结构不均一。

4牦牛心包组织的透射电镜观察

(a)植入前胶原纤维×5000 (b)植入前胶原纤维×3500(c)植入后细胞形态×3000

(d)植入后细胞内结构×8000↑ 钙化N 细胞核M 线粒体ER 内质网

5牦牛心包组织的浆膜层面

a 植入前×700b 植入后×700c 植入后表面有絮状纤维团×3500

图6牦牛心包结缔组织层面表面

a 植入前×210(胶原纤维直条状)

b 植入后×3500

c 植入前×2