关键词: 血栓形成；生长速度；光化学诱发；生物荧光显微镜；微循环；多媒体

本文应用光化学方法在大鼠肠系膜微血管内定位建立活体血小板血栓生成模型，通过生物荧光显微电视系统对整个实验过程进行观察和记录。利用视频多媒体系统和自行开发的计算机图象处理系统，对血栓生长的动态过程进行图象的采样、处理和分析，定量测量了血栓开始形成时间、血栓完全栓塞时间，以及归一化后的血栓长度、血栓高度、血管狭窄截面面积、血栓表面积和血栓体积等指标的时变曲线，并对光化学法致栓模型中血小板血栓的生长速度进行了讨论。本文提出的方法使定量描述血栓的动态生长过程成为可能，为客观评价各类病理条件或药物作用条件下的血栓生长情况提供了定量指标和比较依据。

分类号： R318.01; R331.143

GROWTH RATE OF PLATELET THROMBUS IN A

PHOTOCHEMICALLY INDUCED THROMBOSIS MODEL

Lian Jie, Zheng Xiaoxiang

(Department of Life Science and Biomedical Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027)

ABSTRACTPlatelet thrombus in vivo was induced in rat mescnteric microvessel by irradiation with filtered light in combination with intravenous (i.v.) administration of fluorescent dye. The whole process of the experiment was visualized and recorded in the tape through an intravital fluorescent microscopic system. The dynamic process of thrombus formation was digitized using a multimedia computer system. With a specially developed image processing software, initiation time of thrombus formation, totally occluded time, and the time course changes of normalized thrombus length, thrombus height, cross area, thrombus surface area and thrombus volume were measured quantitatively. Besides, the growth rate of platelet thrombus in this thrombosis model was discussed. The method presented here will be useful for describing the dynamic process of thrombus formation, and evaluating the growth rate of thrombus under different pathological or pharmacological conditions.

Key words:Thrombosis; Growth rate; Photochemically induced; Fluorescent intravital microscopy; Microcirculation; Multimedia

0前言

血栓形成是导致心肌梗塞、脑栓塞、DIC等严重威胁人类生命健康疾病的主要原因，因此，建立稳定的活体血栓模型和可靠的血栓生长评价指标对于研究血栓形成机理和进行抗、溶血栓药物筛选具有十分重要的意义。

活体血栓模型的建立有许多方法，如电刺激法^［1］、ADP滴注法^［2］、激光法^［3］和光化学法^［4］等，其中光化学法致栓由于定位准确、刺激强度可调、易于显微观察和可重复性强等优点，更加适合于活体血栓模型的制作和定量研究^［5］。血栓生长速度的测量一直是国际上实验和理论研究的重点^［2～7］，然而，由于测量手段的限制、测量参数不统一以及数学模型的过分简化，许多文献报道的结果误差较大，难以进行相互比较，甚至会出现彼此矛盾的结论。

本研究利用光化学方法在大鼠肠系膜微血管定位建立活体血栓生成模型，结合计算机图象处理技术，对已有研究工作进行综合和改进，除了常规的血栓开始形成时间(initiation time of thrombus formation, Ti)和血栓完全栓塞时间(totally occluded time, Ts)以外，提出了血栓长度(Length, L)、血栓高度(Height, H)、血管狭窄截面面积(Cross Area, CA)、血栓表面积(Surface Area, SA)和血栓体积(Volume, V)等一系列定量描述和评价血栓动态生长过程的参数指标，并对这些参数进行了归一化，对其时变曲线进行了回归拟合，分析和讨论了其变化规律。

1仪器与系统组成

系统组成与我们以前工作类似，由生物荧光显微系统、显微电视录像系统和多媒体计算机图象处理系统三部分组成。

生物荧光显微系统由BX50型本体显微镜和BX-FLA荧光激发系统组成，购自日本Olympus公司。前者采用透射光照明，用于普通显微观察；后者以100W汞灯为激发光源，经过内置滤光光路产生470～490nm的紫外光，通过与荧光色素发生光化学反应损伤血管内皮，定位引起血小板血栓形成。

利用一只CCD摄像机(MTV-1881Ex，台湾MINTRON公司)将显微图象转换为视频信号在监视器观察并通过录相机记录于磁带上，视频时间信号由MTV-022AB型时间/日期发生器(台湾MINTRON公司)提供。

多媒体计算机系统由HP VL2 4/66微机和Video Blaster多媒体卡(Creative公司，新加坡)组成，完成对血栓形成过程的视频采样、文件管理、图象处理和参数测量等功能。

2活体血栓模型的制备

大鼠肠系膜活体血栓模型的制作按我们以前发表过的方法进行^［8］。

纯种SD大鼠6只，雌雄不拘，体重200～350g,以75mg/kg的戊巴比妥钠溶液麻醉，做气管插管和颈静脉插管，后者用于注射荧光物质。剖腹，小心地取出小肠，置于充满Krebs溶液并维持在37℃的恒温槽中。将肠系膜展开，在显微镜下(目镜10×，物镜20×)寻找一条30～60μm的微静脉准备观察。

开始显微录像，启动视频定时器，观察目标血管内血液流动状态。在5min分钟时打开荧光显微镜激发光光路并照射目标血管，调整落射光斑直径至160μm左右，并使目标血管位于光斑正中，在6min时通过静脉插管注入剂量为2ml/100g体重的1.5%FINa(MW376,日本Kobayashi药业工业有限公司)。由于仅仅注射荧光物质或仅用激发光照射均不使血管内皮受损，只有两者共同作用才会导致内皮损伤而血小板聚集^［5］，故血栓模型的制作从第6min算起。观察血栓形成过程并一直录像，直至目标血管完全被血栓栓塞。

回放录像带，通过多媒体计算机系统，对血栓形成的动态过程进行视频采样，形成序列数字化图象文件并存贮。基于自行开发的图象处理软件，完成各类参数的测量。

3参数测量方法

3.1时间参数

血栓生成的时间参数测量与文献报道相同^［5，7］，从荧光物质进入显微视野到血栓刚刚开始出现之间的时间间隔记为血栓开始形成时间(Ti)，该指标表示血管内皮从接受刺激到出现损伤所经历的时间；从荧光物质进入显微视野到目标血管完全被血栓堵塞所经历的时间记为完全栓塞时间(Ts)。在光化学刺激强度、血液流变性和血管管径相同或近似的情况下，Ti和Ts这两个指标从整体上反映了血栓生长的速度和血管内皮对外界刺激的耐受性。

3.2尺寸标定

由于显微镜放大倍数可调，录像设备在水平方向和垂直方向上放大倍数不同，以及视频A/D采样分辨率和计算机屏幕显示分辨率的限制，在开始几何参数测量以前，必须首先进行水平与垂直方向上尺寸的标定和校正。具体方法是，保持与血栓模型实验相同的显微镜放大倍数和录像条件，分别拍摄显微测微尺水平放置和垂直放置的图象，经视频采样后测量图象文件中一定尺寸水平和垂直方向分别对应的象素数，从而求得水平比例校正系数Fx和垂直比例校正系数Fy。对于图象文件中以象素坐标表示的任意两点P1(x1,y1)和P2(x2,y2)间的实际距离L(P1,P2)则由下式给出：

在本研究中，实际测得Fx=1.18,Fy=1.43。以下测量所用长度变量均指已经过校正后的结果。

3.3几何模型

图1为一段目标血管中形成血栓(阴影所示)的示意图，箭头所指虚线为血管完全栓塞时血栓轮廓。图中左边为血管纵剖面，坐标X轴取为血管轴向。Y轴取为血管径向。右图为坐标X处血管横截面，假设血管为圆柱形，由于目标血管位于刺激光斑的中心，故可假定血管内的血栓近似为轴对称，即血栓造成的狭窄部截面亦为圆形^［5］。图中各几何量意义为：

L1：顶部血栓长度L2：底部血栓长度

H1：最狭窄处顶部血栓高度H2：最狭窄处底部血栓高度

D0：原始血管管径Dx：狭窄处(坐标x)直径

X1，X2：血栓左、右两端点x坐标

L0：完全栓塞时血栓长度

图1微血管内血栓形成的几何模型示意图

4血栓形态参数测量

由于血栓生成近似呈轴对称，故可由纵截面的二维几何参数还原三维信息。本文