关键词: Fenton反应体系；H2O2；红细胞流变性；膜分子流动性

Fenton反应体系是由H₂O₂和二价阳离子配制成的反应体系。为区分Fenton反应体系和单纯H₂O₂作用分别对红细胞膜脂质及蛋白分子流动性影响的不同，本文通过微吸管法、电子自旋共振波谱仪(ESR)、激光拉曼波谱仪等分别对体外Fenton反应体系和单纯H₂O₂作用30分钟后，及恢复3小时后的红细胞膜剪切弹性模量μ、细胞表面指数Si、膜整体结构、膜蛋白分子τp及脂质分子τl相对旋转时间进行了比较分析。结果发现，①Fenton反应体系导致了红细胞膜的μ值明显增加，但Si无明显改变；②Fenton反应体系使红细胞膜中的β-胡罗卜素构象的卷曲形式增加，提示膜整体结构改变；③Fenton反应体系致使红细胞膜蛋白分子τp及脂质分子τl明显延长；④恢复3小时后除红细胞膜脂分子τl值外，上述改变的可逆性较差；⑤H₂O₂作用只引起红细胞膜τp值增加，但并未影响膜脂质分子流动性和红细胞变形性；因此证明Fenton反应体系作用后红细胞流变性的改变主要为其中的自由基损伤所致。

分类号： R318.01; R331.141

COMPARISION STUDY OF DAMAGING EFFECT

OF FENTON SYSTEM AND H₂O₂ ON MOLECULLAR

RHEOLOGY OF RBCs MEMBRANE

Huang Yimin, Yu Xin, Zhao Hui

(Beijing Institute of Heart Lung & Blood Vessel Disease, Beijing 100029)

Guo Jinliang, Sun Suqin, Gong Yandao, Li Yong

(Tsing Hua University, Beijing 100084)

ABSTRACTFenton system derived free radicals by way of H₂O₂ and divalent cations such as Fe²⁺ or Cu²⁺ reaction to damage RBC. However, H₂O₂ could also produce free radical under direct action of Fe²⁺ catalysis on RBCs membrane surface or inside of RBCs. Here we used the micropipette, ESR and Laser-Raman spectrumeter to investigate and compare the differences of RBCs rheological damage, including membrane shear elastic modulus (μ), cell surface index (Si), membrane intact, the molecular rotational correlation times of the membrane proteins (τp) and lipids (τl) between Fenton system and H₂O₂. Results showed that (1) with Fenton system reaction for 30 minutes, led to a significant increase of μ of RBCs membrane but no Si change; (2) Fenton system induced increase of coil-form of β carotene of RBC membrane, indicating disturbance of membrane integrity; (3) prolonged τp and τl were fundamental causes of decrease of RBCs membrane fluidity, resulted from Fenton system action; (4) after 3 hours recovery, the changes of rheological parameters of RBCs were less reversible except for membrane lipid τl; (5) H₂O₂ only resulted in a reduction of membrane protein τp, but not on membrane lipids fluidity and RBC deformability. All the above confirmed that free radical damaging effect was responsible for disturbance of RBC rheological property after action of Fenton system.

Key words: Fenton system; H₂O₂; RBC rheology; Molecular fluidity

0前言

红细胞的流变性是其顺利通过毛细血管完成与组织的氧交换的重要保证。红细胞膜的流动性、细胞浆的内粘度和细胞几何学特征是决定红细胞流变性的三个最主要的因素^［1］。红细胞膜磷脂双层分子是不对称性分布的，它们不停地进行着轴旋转、烃链的摆动及同层水平扩散等三种主要运动：一些膜蛋白(如一些受体、酶和离子通道等)也在脂双层中不停地旋转和扩散；这种分子运动不仅是红细胞膜流动性的基础，同时也是这些分子发挥功能的必须条件^［2～6］。由于膜骨架上的多种蛋白相互连结而形成的网状结构，因此不具有独立的及随机的运动；除在膜内侧起着细胞膜的支撑作用外，通过其部分蛋白分子侧链嵌入膜脂双层而达到稳定及调节膜流动性的作用^［7］。细胞膜骨架是红细胞膜弹性和几何学特征的主要决定因素。

自由基是含有不配对电子的高活性物质，它通过电子传递而与其它分子发生氧化-还原反应。前期大量的研究已证明自由基特别是以氧为中心的自由基通过脂质过氧化而引起膜脂分子结构的改变，表现为烃链碳-碳双键的减少和游离脂肪酸的释放，此外自由基对蛋白分子的攻击可造成蛋白分子结构及功能的改变^［8］。

红细胞由于有一个高氧含量并与氧反复混合，细胞膜又含有大量的高活性碳-碳双键的多不饱和脂肪酸，其极易吸附氢原子、胞内血红蛋白可提供催化产生损伤性自由基的铁离子而对过氧化损伤极其敏感^［9］。

在人体含有的一系列自由基清除系统中，SOD首先将氧自由基转化成H₂O₂，之后过氧化氢酶再将其分解为水，从而消除自由基的损伤。但是未被及时清除的脂溶性H₂O₂可竞争性地进攻细胞膜，并在细胞膜上或细胞内的二价阳离子的作用下再被转化为自由基而引起细胞的损伤^［10］。过去的许多体外研究采用由H₂O₂和二价阳离子(铁Fe²⁺或铜Cu²⁺)配制的Fenton反应体系作为自由基产生源，观察研究自由基的损伤机理，并得出可靠的成果。但是由于反应底物中存在着H₂O₂，因此不能完全排除H₂O₂在细胞水平的研究中对细胞的直接伤害。

为比较Fenton反应体系和H₂O₂引起红细胞流变性改变特征的差别，有效区分Fenton反应体系中的自由基和H₂O₂损伤红细胞流变性的作用机理，本文对体外Fenton反应体系、单纯H₂O₂作用前后及恢复3小时后人红细胞流变学参数、红细胞膜整体结构、红细胞膜脂质及蛋白分子流动性的改变进行了比较研究。

1材料和方法

1.1Fenton体系

1.1.1根据我们前期动物心肌缺血/再灌注的实验模型中用ESR测定的心肌自由基产生时相主要为再灌注即刻至再灌注后的30min左右，且自由基的产生量大于10至12μM/g心肌。因此确定本研究的体外实验采用Fenton反应体系，对红细胞损伤时间为30min。

1.1.2Fenton反应体系产生自由基的稳定性：按照下列方法配制高、低浓度的Haber Weiss(Fenton)体系。高浓度按1∶1∶1的容积比将3%的H₂O₂、450μmol/L的FeSO₄和2.7%的NaCl混合制成等渗、pH7.0的体系；低浓度按0.5∶1∶1.5的容积比将3%的H₂O₂、450μmol/L的FeSO₄和1.8%的NaCl混合制成等渗、pH7.0的体系。分别在以上体系配制后的即刻、10min、30min和1h用自旋捕捉剂DMPO(5,5-DIMETHYL-1-PYROLINE N-OXIDE,Sigma)捕捉自由基，并于室温条件下用电子自旋共振波谱仪(ESR Bruker ER-200D)在微波功率SP=10mW(13db)、调制幅度MA=5G、放大增益GN=5×10⁴、中心磁场CF=3470G、扫场宽度SW=200G的条件下重复测定三次自由基产生水平，并由此得到了典型的1∶2∶2∶1自由基ESR波谱，证明配制后即刻已产生大量自由基且在1h内其浓度不变。

1.2Fenton体系对人红细胞的损伤及损伤后红细胞的恢复

10名健康成人新鲜红细胞(男女各5名)经等渗磷酸缓冲液(PBS)清洗两遍后，分别与以上两Fenton反应体系在室温条件下作用30min。作用后的红细胞经PBS清洗两遍后部分进行细胞流变学和细胞膜分子流变学参数的测定，部分再于室温条件下重新悬浮于PBS中静置(恢复)3h，之后再测定细胞流变学和细胞膜分子流动性参数。

1.3过氧化氢H₂O₂对红细胞流变学和细胞膜分子流动性参数的影响

由于Fenton反应体系主要是由H₂O₂和Fe²⁺离子(或Cu²⁺离子)配制而成，根据化学动力学的原理，此体系中应同时含有氧自由基(O^·₂)、羟自由基(^·OH)和反应底物H₂O₂。因此必需排除H₂O₂对红细胞流变学和分子学参数的影响。除上述实验外，将10名健康成人新鲜红细胞同时再分别与1%和0.5%的等渗H₂O₂-PBS液作用30min，作用后的红细胞经PBS清洗两遍后进行细胞流变学和膜分子流动性参数的测定。

1.4红细胞流变学和细胞膜分子流动性参数的测定

1.4.1红细胞流变学参数测定

对每份待测的红细胞悬液，应用