关键词: 碱性磷酸酶(AKP)；生物瓣钙化；缓钙化；牛磺酸；偕二膦酸盐

钙化是限制生物瓣使用寿命的主要因素。前人对组织的钙化和防钙化进行过较为全面的研究，最近又从分子生物学角度揭示细胞凋零和钙化的关系，其中不同程度都涉及到碱性磷酸酶(AKP)。本文通过对植入生物瓣材料的大鼠血液的生化分析，探讨了AKP与生物瓣钙化的关系，获得了一些有价值的结论，为生物瓣的缓钙化提供了十分有用的依据。

分类号： R318.08; R654.2

ALKALINE PHOSPHATASE AND CALCIFICATION

oF BIOPROSTHETIC VALVE TISSUE (Ⅰ)-SERUM

pHOSPHOROUS AND TISSUE CALCIFICATION

Liu Xia, Wan Changxiu, Yue Yilun

(Institute of Biomaterials and Biotechnology, departement of Polymer

science and Materials, Sichuan Union University, Chengdu 610065)

ABSTRACTFrom the angle of molecular biology of cells, the relationship between apoptosis and calcification had been explored recently, which was related to alkaline phosphatase in different degrees at the site of calcified tissues. In accordance with the results of serum analyses of Wistar rats, this article showed that the conditions of calcified tissues implanted reflected the serum phosphorous level of the testing animals. By reducing the serum phosphorous level with drugs, the degree of the calcification of the tissues could be reduced, while the bone metabolism of the animals would be interrupted seriously. It seemed that calcification of the tissues could be delayed with the inactivation of AKP activity in serum by means of inhibitors or anticalcififcation drugs such as diphosphonates containing P-C-P enzymatic stable bond. Besides, some valuable data observed were useful for delay of calcification of tissues.

Key words: Alkaline phosphatase; Bioprosthetic valve tissue calcification; Calcification-delayed; taurine; Diphosphonate

0前言

当前生物瓣面临的主要问题在于植入体内后的使用寿命远比机械瓣短^［1～4］，主要原因是由于钙化和原发性胶原组织退变而引起的瓣叶撕裂、穿孔、或钙化变硬等，致使瓣膜失效。通常因钙化，瓣膜的使用寿命多数介于7至10年。据统计，生物瓣在体内因钙化丧失其功能的发生率，成年人在10年后为10%，儿童在5年后为50%。因此，1983年底在美国NIH举行的心血管年终科研报告会上，把研究生物瓣的钙化机理和防钙化措施列为人工心瓣的一项重要课题。

目前，临床上对钙化造成生物瓣失效的病例分析甚多，但对生物瓣钙化和缓钙化机理的深入研究却十分有限，远不如对生理性钙化机理的认识。碱性磷酸酶(AKP)与钙化过程有关，这点早有报道^［5］。在软骨钙化过程中，AKP在钙化的边缘处活力明显增加，但该酶的功能和生理性底物仍未揭晓，推断AKP在钙化过程中的作用是^［6，7］：(1)水解有机磷酸酯，使局部无机磷浓度升高，促使磷酸钙沉淀；(2)通过其水解作用破坏生理性晶体生长抑制剂，如无机焦磷酸(PPi)和ATP；(3)充当磷的运输者；(4)通过其ATPase水解力，主动运输Ca²⁺和无机磷酸Pi。为了探寻AKP与生物瓣钙化的关系，作者着手于以下三方面的研究：通过植入生物瓣材料的大鼠血液的生化分析，研究血磷与材料钙化的关系；通过植入材料的组织学和细胞生物学变化，研究AKP与钙化位点的关系；从大鼠骺骨生长板的体外钙化实验，比较AKP在生理性钙化和生物瓣钙化中的作用。本文仅涉及血磷与材料钙化的关系。

关于血磷对生物瓣钙化的影响，目前发现幼年动物与青少年患者中移植的生物瓣钙化明显高于成年人^［8～13］，同时也发现它们的体内含有较高的血磷^{［14，15］}，较高的血磷与体内内分泌代谢有关，但血磷与生物瓣钙化的关系仍不清楚。AKP水解有机磷酸酯，使PO^3-₄积累，血清AKP水平对生物瓣钙化是否有直接或间接的作用仍待探讨。在生物瓣缓钙化措施的研究中，也发现全身注入偕二膦酸钠虽然能明显抑制生物瓣钙化，但对动物的生长、骨骼发育、钙代谢等有严重的不良影响^{［16，17］}。现已知道骨骼的矿化依赖于正常的AKP活动^{［18，19］}。焦磷酸是体内一种天然钙化抑制剂^{［20，21］}，AKP的生理性作用之一是破坏生理性晶体生长抑制剂，使钙化启动^［6，7］，而偕二膦酸盐又是类似于焦磷酸的一类化合物，但它具有酶学上稳定的P-C-P键^{［20，21］}，因此不会被催化分解而失去抑制钙化的活性。所以涉及到生物瓣缓钙化的问题，对AKP的作用是不容忽视的。

为了探讨血磷对生物瓣钙化的影响，本文采用：(1)导致软组织钙化的药物，如维生素D₃^{［22，23］}，中性磷酸盐^{［15,24～28］}和导致钙超载的药物^［29］；(2)缓钙化药物，如AlCl₃^{［30～35］}，1-氨基丙烷羟基二膦酸钠(Na₂APDP, disodium aminopropanehydroxydiphosphonate)、乙烷羟基二膦酸钠(Na₂EHDP, disodium ethanehydroxydiphosphonate)^{［16，17，21，33，36～39］}；(3)降低或抑制AKP活力的药物，如放线菌酮^［40］，左旋咪唑^［41］；(4)钙稳态调节剂^{［29，42～51］}，如牛磺酸等，从生物瓣组织钙化程度的变化，跟踪实验性动物血磷(血液)的变化，研究AKP等综合性因素对生物瓣组织钙化的影响。

1材料和方法

1.1实验动物

体内动物实验选用3周龄，健康纯种雄性SD大鼠，体重60～80g；体外钙化实验选用刚断乳的纯种雄性SD大鼠，体重35～50g。实验动物由四川抗菌素工业研究所提供。

1.2实验材料

采集4～6岁健康完整的牦牛心包，在2小时内，按我室的方法剥去心包结缔组织表层的脂肪组织，切取心前区部分，用无菌Hanks液反复漂洗^［53］，然后在我室自制的生物心包固定操作箱内的网板上，用环氧交联剂处理^［54］，最后在4℃～10℃冰箱内，贮存于防霉液中。

1.3试剂

尼古丁为Merck产品；左旋咪唑、牛磺酸、N-Tris-(hydroxymethyl)methyl-2-amino-ethane sulfonic acid(TES)为Sigma产品；维生素D₃为上海第九制药厂产品，批号920103；偕二膦酸盐Na₂APDP和Na₂EHDP为本室合成；⁴⁵CaCl₂的放射性活度为222MBq^。g^-1，为北京中国原子能科学研究院产品；血清钙测定试验盒为北京中生生物工程高技术公司出品；血清无机磷测定试剂盒为上海荣盛生物试剂厂出品；血清AKP及血清总蛋白测定试剂盒为上海长征医学科学有限公司出品。其它试剂均为国产分析纯。

1.4植入材料

将环氧交联剂改性后的牦牛心包组织，剪成1cm×1cm的小方片，用无菌的0.9%NaCl(生理盐水)反复冲洗，备用。对用于体内实验的大鼠腹腔注射戊巴比妥钠50mg/kg体重，进行手术前麻醉^［55］，再用8%的Na₂S水溶液脱毛，然后消毒皮肤，将实验材料植入大鼠的左、右背脊皮下部位，每只大鼠2片，间距大于2cm^［56］。

1.5测试

将牦牛心包组织在皮下埋植3周后的大鼠称量，计算其体重增长率，然后将大鼠股动脉放血处死，分离血清，测定血清钙、血清磷、血清AKP、血清总蛋白以及血清AKP同工酶的百分含量等指标。并对从大鼠皮下取出的牦牛心包组织，测定其钙含量。实验结果以均值±标准差(X±SD)表示，方差分析采用t检验，显著性水准为P＜0.05。

1.5.1血液生化指标^［57］

血清生化成份分析测试仪为ISP-M型半自动化生化仪。血清钙测定方法为邻甲酚酞络合酮法；血清磷测定方法为直接紫外光度法；血清AKP测定方法为磷酸对硝基苯基质动力学方法。血清AKP同工酶的百分含量按文献［41］测定；血清总蛋白测定方法为双缩脲法。

1.5.2钙含量测定

生物瓣组织钙含量测定方法为原子吸收分光光度法^［58］。将未植入动物体内的实验材料作对照，与动物体内埋植后的实验材料同时进行测定，将待测样品置于105～110℃干燥箱内烘干至恒重，称量，然后溶于10ml1∶1(V/V)浓盐酸水溶液中进行消化，再移入100ml容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，最后用WYX-402型原子吸收分光光度计(沈阳)测定样品溶液中的钙含量，结果用mg/g表示。

1.6动物实验

将健康纯种雄性SD大鼠随机分组，每个剂量组5只，按相应实验要求给予处理。

1.6.1钙化与抑制钙化实