摘要以原代肝细胞、肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)细胞及对人工基底膜Matrigel具有侵袭能力的HCC细胞(HCC-Inv细胞)为研究对象，研究了三种细胞的粘弹特性、与胶原蛋白Ⅰ的粘附力学特性及与肝血窦内皮细胞(Liver sinosoidal endothelial cell, LEC)的粘附力学特性。结果发现，HCC细胞的上述流变特性较之于肝细胞发生明显的变化；与肝细胞及HCC细胞相比较，HCC-Inv细胞表现出高的粘弹特性，高的与胶原蛋白Ⅰ的粘附力，高的与LEC的粘附力；免疫细胞化学的结果证实了HCC细胞与HCC-Inv细胞形态与细胞骨架结构的差异。作者对肝癌细胞流变特性改变及病理学意义作了简要讨论。

Invasion Behavior of Hepatocellular Carcinoma Cells Correlates with Their Rheological Properties

Wu ZezhiWang XianhangZhang GangLong MianCai Shaoxi

(College of Bioengineering, Chongqing University,Chongqing400044)

Luo Xiangdong

(Burn Institute，The 3^rdMillitary Medical University,Chongqing400038)

AbstractWe investigated the viscoelasticity,mechanics of adhesion to collagen I coated surfaces and mechanics of adhesin to liver sinosoidal endothelial cells(LECs) among primary culture human hepatocytes,hepatocellular carcinoma(HCC) cells as well as HCC-Inv cells,namely HCC cells capable of invading the artificial basement membrane,Matrigel.The results showed that the above-mentioned rheological properties of HCC cells differed obviously from those of normal hepatocytes.HCC-Inv cells exhibited higher viscoelastic coefficients,higher adhesion forces to collagen I coated surfaces as well as higher adhesion forces to LECs than those of normal hepatocytes and HCC cells.Immunocytochemistry showed the differences in cell morphology and cytoskeleton structure between HCC cells and HCC-Inv cells.A brief discussion was presented in relation to the changes in cell rheological properties of hepatocellular carcinoma cells and their pathological significance.

Key wordsCarcinoma，hepatocellularCollagen IMatrigelLiver sinosoidal endothelial cells Cell rheology

1引言

恶性肿瘤的侵袭行为及机制是当今肿瘤学的前沿性研究课题。80年代，美国国立癌症研究所Liotta等人^［1］提出了肿瘤细胞侵袭心指导和大力协助的三步设想，这使人们对肿瘤细胞的侵袭过程有了一个更清晰的认识。现今人们知道，肿瘤细胞的侵袭是以细胞的粘附、运动及变形为基础的复杂病理生理过程，其间伴随机体多种屏障机制的丧失。为了阐明恶性肿瘤细胞侵袭和转移的机制，人们重视研究肿瘤细胞的粘附、运动行为以及与之相关的肿瘤细胞粘附分子和细胞骨架的改变^［2，3］，与此同时，在癌组织中作为肿瘤组织侵袭屏障和肿瘤细胞运动和变形的力学支撑结构的胞外基质也越来越引起人们广泛的研究兴趣^［1，2］。尽管如此，对恶性肿瘤细胞侵袭和转移机制的认识还远未深入和完善。在这里，以新的研究手段从新的角度进行有关研究已成为必要。

我们以原代培养肝细胞、肝癌(HCC)细胞以及对人工基底膜Matrigel具有侵袭能力的侵袭性肝癌细胞(HCC-Inv细胞)为研究对象，首先以微管吸吮技术(Micropipette aspiration technique)研究了3种细胞的粘弹特性、在胶原蛋白I裱衬表面和与肝血窦内皮细胞(LEC)的粘附力学特性，进一步，为了了解细胞流变特性改变与细胞骨架的关系，作者用抗生物素—生物素—过氧化酶复合物免疫细胞化学染色法(Avidin biotin-peroxidase complex technique，ABC法)考查了HCC细胞和HCC-Inv细胞微丝、微管及中间丝在胞内的状态。作者对肝癌细胞流变特性改变及其病理意义进行了简要讨论。

2材料与方法

2.1主要试剂及药品

胶原蛋白酶IV购自美国Sigma公司，以Hanks液配成0.05%的溶液备用。RPMI1640培养液购自美国Gibco公司，完全培养基含10%的小牛血清，0.03%的谷胺酰胺，100 单位/ml的青霉素及100 μg/ml的链霉素。多聚赖氨酸(Poly-D-lysine,PDL)购自美国Sigma公司，以三蒸水稀释至2 μg/ml后分装备用。胶原蛋白I购自美国Sigma公司，以0.1 N的醋酸(pH3.5)溶解后，用三蒸水稀释成500 μg/ml的储备液，临用前以三蒸水进一步稀释至工作浓度(1、2、5 μg/ml)。牛血清白蛋白(BSA)购自华美公司，以等渗磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH7.4)配成浓度为0.5%的溶液备用。Matrigel购自美国Collaborative Res公司，以RPMI1640培养液稀释至500 ng/ml备用。鼠抗人单克隆抗体Anti-β-tubulin购自德国宝灵曼公司，编号1111876，储备液浓度50 μg/ml，工作稀释度为1∶25；鼠抗人单克隆抗体Anti-actin购自德国宝灵曼公司，编号1378996，储备液浓度为1 000 μg/ml,工作稀释度为1∶100；鼠抗人多克隆抗体Anti-keratin购自重庆医科大学病理生理教研室，储备液浓度为1 000 μg/ml,工作稀释度为1∶45。ABC法免疫细胞化学试剂盒购自华美公司，批号6020。3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)显色试剂盒购自重庆医科大学病理生理教研室。其余试剂均为国产AR级。

2.2细胞分离、培养及细胞样品的制备

正常胎肝组织取自第三军医大学附属西南医院，肝组织经0.05%胶原蛋白酶IV消化后用分步离心沉降或等密度梯度离心的方法分离和纯化正常肝细胞^［4，5］，LEC的进一步纯化采用在玻璃表面及PDL裱衬表面的选择性粘附的方法进行^［5］。肝细胞以约2×10⁵/ml的浓度接种于普通细胞培养皿，LEC以约1×10⁶/ml的浓度接种于经下述PDL裱衬的园形小室的玻璃表面。以RPMI1640完全培养基常规培养，肝细胞经至少48 h的稳定贴壁培养后经制样用于微管吸吮实验，LEC经2～3 d形成融合单层后用于细胞粘附力学实验。

HCC细胞(SMMC7721)购自第二军医大学并在本实验室传代培养。HCC-Inv细胞的筛选采用Boyden小室法。Boyden小室上下室之间用孔径8 μm的无PVP聚碳酸酯膜(Neuro Probe公司，美国)隔开，膜上涂布500 ng/ml的Matrigel(人工基底膜)，下室加入NIH3T3细胞培养液，在上室内加入5万/0.5 ml肝癌细胞悬液，常规培养6～12 h，收集滤膜底面的细胞于下室内常规培养约10 d，HCC-Inv细胞密度增加并铺满下室底面。

2.3微管吸吮实验

2.3.1细胞粘弹性实验正常肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞经0.02%EDTA/0.05胰蛋白酶消化后以RPMI 1640细胞培养液制成细胞悬液，粘弹性实验参照先前报道的方法进行^［6］。以K₁、K₂和μ作为表征细胞粘弹特性的客观物理量。

2.3.2细胞在胶原蛋白I裱衬表面的粘附力测定玻璃表面的裱衬：取一以玻璃为底表面的特制园形小室，在约0.5 cm²的园形区域内依次裱衬如下成分：(1)2 μg/ml的PDL200 μl，37 ℃裱衬40 min；(2)不同浓度(1、2、5 μg/ml)的胶原蛋Ⅰ200 μl，37 ℃裱衬30 min；(3)0.5%BSA 200 μl,37 ℃作用15 min。各步裱衬结束后均以PBS轻轻洗涤1～2次。制备好的裱衬小室在37 ℃的细胞培养箱内保存，于24小时内完成有关实验。

粘附力的测定系将约0.5 ml浓度约1×10⁵个细胞/ml的肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞悬液加入上述裱衬好的园形小室，37 ℃静置15 min后，轻轻吸出细胞悬浮液以去掉未粘附细胞，重新加入RPMI 1640培养液，将小室置于倒置显微镜载物台上进行微管吸吮实验。于显微镜下确定待实验的细胞后利用显微操作器引导微管尖端(内经约5～6μm)靠近细胞表面，通过压力控制系统产生一阶跃负压以吸吮细胞，使细胞的一小部分被吸入微管并密封管口，以显微操作器轻轻侧向牵引细胞离开其粘附的裱衬表面。逐步加大负压(步长5～10mmH₂O)直至求得能使细胞与相应裱衬表面间粘附分离的临界负压值。在实验中，以电视摄像磁带记录的方式记录实验过程，经电视回放输入图像处理仪进行有关测量。整个微管吸吮实验在2 h内完成。

细胞粘附力采用下式计算：F=ΔΡπ(Rp)²。其中ΔP为细胞粘附分离的临界负压值，π为园周率，Rp为微管尖端内半径。

2.3.3细胞与LEC的粘附力测定取出经方法1.2制备的含融合单层LEC的特制园形小室，丢弃培养液，以Hanks液清洗1～2次，分别加入浓度约1×10⁵个/ml的肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞。37 ℃静置60 min，参照文献［7］及上述方法2.3.2进行细胞粘附力测定，选取细胞粘附于LEC靠近核的中央区域的粘附细胞对进行测量，压力步长为1～2 mmH₂O。整个微管吸吮实验在2 h内完成。

2.4免疫细胞化学实验^［8］

将HCC细胞及HCC-Inv细胞分别接种于盖玻片上，2～3 d后即良好贴壁生长，选取细胞密度适中的玻片，微温热风干1 h，甲醛丙酮液常规固定2 min。以ABC法进行常规免疫化学染色^［8］，明胶封片，油镜镜检，1000×照像。

2.5统计学处理