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Effects of Extremely Low Frequency Weak Magnetic Fields
on the Intracellular Free Calcium Concentration
in PC-12 Tumor Cells
Huang ChunmingYe HuiLiu Jiarui
（Dept. of Bioengineering, Huazhong Univ of Sci & Tech, Wuhan430074）
Xu JianhuaQu Anlian
（Inst. of Biophysics & Biochemistry, Huazhong Univ of Sci & Tech, Wuhan430074）
Abstract：In this study the effects of the extremely low frequency (ELF) magnetic fields on intracellular Ca2+ concentration (［Ca2+］i) of rat chromaffinoma PC-12 cells were examined by using a digital fluorescence image microscopy system. A 50 Hz, 100 μT sinusoidal ELF magnetic field increased ［Ca2+］i to a marked level, whereas a static field or a field of higher frequency (2000 Hz) did not cause a ［Ca2+］i increase. The magnetic field-induced ［Ca2+］i rise was partly due to an influx of extracellular Ca2+ and partly due to the release of intracellular Ca2+ pool. It seemed likely that the Ca2+ transport ability of the cell membranes was increased by the 50 Hz magnetic field.
Keywords：Extremely low frequency magnetic fieldMicrofluorimetryIntracellular free calcium concentration▲
1引言
近年来，有关交流时变磁场的生物效应研究广泛展开。随着用电量的增大，人们越来越关心低能量的极低频磁场对生物体的影响。由于缺乏严谨完善且为大家所普遍接受的生物物理机制，极低频弱磁场是否能对活的有机体产生影响仍大有争议。许多研究者以实验证明极低频弱磁场的确会引起显著的生物效应，而另外一些科学家却从势噪声限制条件出发推出了否定的结论。已报道的极低频弱磁场的生物效应包括刺激神经再生、改变基因转录和细胞繁殖等，Ca2+在这些效应的传导中所起的作用已有论述，也有Ca2+参与的证据。细胞溶质Ca2+稳定是调节各种生物效应的关键，具有重要的生理意义。本文以Fura-2为荧光指针，研究了同等强度(100μT)而频率不同的正弦磁场对PC-12瘤细胞胞内游离钙离子浓度的影响。实验结果表明PC-12细胞确实能对极低频弱磁场做出反应且具有频率特异性，胞内增加的Ca2+部分源于胞外Ca2+的跨膜内流，部分源于胞内钙库的释放。
2材料
(1)Fura-2/AM，胰蛋白酶，Hepes等，SIGMA公司产品；DMEM培养基，胎牛血清等，GIBCO产品；磁场发生装置与线圈自制；大鼠嗜铬细胞瘤PC-12株系细胞来自同济医科大学；
(2)细胞外液成分(mmol/L) NaCl 140，CaCl2 1.0；MgSO4 0.4,MgCl2 0.5,KCl 5.0,NaHCO3 3.0,KH2PO4 0.4,Na2HPO4 0.6, Hepes 20,D-Glucose 10(pH=7.3)；
(3)无钙液(D-Hanks)成分(mmol/L) NaCl 140,KCl 5.0, Na2HPO4 H2O 0.4, KH2PO4 0.4, NaHCO3 4(pH=7.4)；
(4)钙溶液成分(mmol/L) CaCl2 100。
3方法
3.1细胞的荧光负载
在细胞外液中加入适量的Fura-2/AM荧光探针至终浓度4 μmol/L，37 ℃下温育30 min［6］，然后用细胞外液冲洗三次，以除去未负载的Fura-2/AM，将贴附着细胞的盖玻片置于测定槽中，滴加500 μl细胞外液或D-Hanks液。
3.2磁场照射
采用自制正弦电流发生装置与圆形线圈产生磁场。正弦电流大小、频率可调。线圈直径D＝9.8 cm，以直径0.7 mm的漆包铜线紧密绕制而成，总匝数N＝25。线圈中心处磁感应强 度的大小根据B＝μ0IN/D计算［7］。其中μ0＝1.257×10-6H·m-1是真空磁导率，I是线圈中的电流强度(A)。实验选择磁感应强度B＝100 μT，磁场频率f=0、50、2000 Hz。静磁场由外接稳压电源产生的直流电流流过线圈产生。实验时线圈置于工作台上，测定槽置于线圈中央。
3.3单细胞的［Ca2+］i测量
我们用75 W的氙光源作为荧光激发光源，该光源通过一可程控转角的光栅反射后成为单色光源(T.I.L.L.Photonics,Genmany)，通过计算机选择不同波长的单色光，其响应时间为2 ms，单色光通过一段光纤导入屏蔽罩，通过倒置荧光显微镜(Zeiss Axiovert 100,Germany)的激发荧光通路，由分光镜反射后经40X，NA 0.75的plan Neofluar紫外物镜聚光后照射在贴附于盖玻片底的细胞上。细胞受激发产生的荧光通过物镜，500 nm带通滤光片的光阑进入光电倍增管。记录范围由光阑限制在直径为18 μm的圆圈内。光电倍增管的输出信号经10 KHz的频率采样送计算机(Apple Macintosh Quadra 650,USA)处理。
3.4Fura-2荧光微量测量法原理
Fura-2［8］是疏酯分子，不能自由进入细胞，它是以乙酰羟甲基酯即Fura-2/AM的形式负载入目标细胞的。进入细胞后，胞浆内的非特异性酯酶可将Fura-2/AM水解为Fura-2，与胞浆内游离Ca2+结合形成Fura-2-Ca2+化合物。当激发波长大于370 nm时，该化合物的荧光强度随Ca2+浓度的升高而降低；而当激发波长小于370 nm时，该化合物的荧光强度随Ca2+浓度升高而升高。实验中记录激发波长分别为345 nm和380 nm时的发射荧光强度F345和F380以及它们的比值：quot=F345/F380，该值反映［Ca2+］i的变化情况。
4结果
(1)在标准细胞外液下，采用50 Hz，100 μT正弦磁场对细胞照射一段时间后，一般引起［Ca2+］i升高，升高曲线平缓。开始出现升高的时间以及升高的幅值随细胞不同而不同，但一般在照射20 min后都有明显的变化。随着照射时间的增加，［Ca2+］i上升速度逐渐加快，出现另一个时间常数。在磁场加入前后各记录30例细胞的瞬时quot值作统计分析。结果表明经过60 min的照射，细胞的平均quot值由740.0±104.4上升至863.0±181.4，［Ca2+］i明显上升。图1是50 Hz，100 μT磁场照射下的［Ca2+］i动态曲线图谱，对该曲线进行指数拟合，其时间常数τ分别是6.8×10-4(ab)和1.6×10-3(cd)。说明在照射期的前15 min内是一个相对缓慢的上升过程，而在15 min后是一个相对快速的上升过程。
图150Hz, 100 μT正弦磁场引起PC-12细胞［Ca2+］i上升
Fig 1 The increase of ［Ca2+］i of PC-12 cells results from 50Hz, 100 μT sine magnetic field
(2)同等强度的较高频率正弦磁场(2000 Hz,100 μT)在约1 h的照射期内不能引起［Ca2+］i的变化(n=4)(图略)。照射前后的平均quot值分别为548.2±47.4和541.8±46.6(n＝30)。
在2000 Hz磁场照射一般时间后，［Ca2+］i并无变 化，此时再换用50 Hz磁场照射，［Ca2+］i都有不同程度的升高(n＝4)，这表明细胞对50 Hz磁场的敏感性强。图2是一例经2000 Hz，100 μT磁场照射55分钟后转用50 Hz磁场照射的［Ca2+］i变化曲线，说明了这一现象。照射前的平均quot值为598.0±273.0，2000 Hz磁场照射后的平均quot值为608.4±207.7，换用50 Hz磁场照射后的平均quot值为719.0±248.4(n=30)。
