摘要为了定量研究转化人胚腱细胞(Transformed human embryonic tendon cells, THETCs)在聚乳酸(Polylactic acid, PLA)和聚乳酸与羟基乙酸共聚物85/15(Polylactic-co-glycolic acid, PLGA 85/15)表面上的粘附特性，我们采用微管吸吮技术测定了单个THETC与PLA膜(平均厚度18.6 μm)和PLGA85/15膜(平均厚度17.3 μm)表面的粘附力学特性。结果显示，THETC与PLA膜和PLGA85/15膜表面的粘附率和粘附力明显大于膜表面裱衬牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)实验组，同时小于膜表面裱衬聚赖氨酸(Poly-D-lysine, PDL)实验组，而且PLGA85/15膜更易于THETC粘附。表明BSA能抑制THETC在聚合物膜表面的粘附，而PDL能增强其粘附。提示PLGA85/15预涂PDL是一种新型的THETC贴附基。

A Study on Adhesive Properties of Transformed Human

Embryonic Tendon Cells to PLA and PLGA

Qin TingwuXie HuiqiYang ZhimingQin JianCai ShaoxiXu Shirong

Department of Orthopedic Surgery, First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu610041

Bioengineering College of Chongqing University, Chongqing400044

AbstractTo study the adhesive properties of transformed human embryonic tendon cells (THETCs) to polylactic acid(PLA) and polylactic-co-glycolic acid 85/15 (PLGA 85/15), the adhesive mechanical properties of single THETCs to PLA films (average thickness 18.6 μm) and PLGA 85/15 films (average thickness 17.3 μm) were measured by means of micropipet aspirating technique. The rsults showed that the attachment rate and adhesive force for two polymer groups(PLA precoated with bovine serum albumin (BSA) and PLGA 85/15 precoated with BSA) were significantly lower than those for two control groups(PLA and PLGA 85/15), respectively, while the attachment rate and adhesive force for other two polymer groups (PLA precoated with poly-D-lysine (PDL) and PLGA 85/15 precoated with PDL) were significantly higher than those for two control groups, respectively, and that the adhesive properties of THETCs to PLGA 85/15 films were better than those of THETCs to PLA films. These demonstrate that BSA can inhibit THETCs attachment to polymer, and PDL can promote THETCs attachment to polymer, and suggest that PLGA 85/15 films were better than those of THETCs to PLA films. These demonstrate that BSA can inhibit THETCs attachment to polymer, and PDL can promote THETCs attachment to polymer, and suggest that PLGA 85/15 coated with PDL may be used as a new type attachment substrate for THETCs.

Key wordsTransformed human embryonic tendon cellsPolylactic acidPolylactic-co-glycolic acidAdhesion

1前言

肌腱组织工程研究是近年来肌腱损伤修复研究的一个热点。肌腱细胞外基质支架的研究是构建组织工程化肌腱，并最终用于临床的关键^［1］。细胞外基质支架研究的重要问题是筛选出适于肌腱细胞锚着，易于肌腱细胞粘附的材料。纵观这一领域，肌腱细胞对材料的粘附性，或称肌腱细胞对材料的选择性的研究^［2］已经展示出诱人的前景，但很少作定量的粘附力学特性研究。人工合成的生物可降解高分子聚合物聚乳酸(Polylactic acid, PLA)和聚羟基乙酸(Polyglycolic acid, PGA)是美国食品和药品管理局认可的体内植入材料，目前已广泛用作组织工程化组织的胞外基质支架^［3］。但PLA强度较差而PGA柔韧性欠佳，不适于作肌腱细胞外基质支架，因此本文选择了PLA及其与PGA的无规共聚物—聚乳酸与羟基乙酸共聚物85/15(Polylactic-co-glycolic acid, PLGA85/15)，采用微管吸吮技术(Micropipet aspirating technique)，探讨了转化人胚腱细胞(Transformed human embryonic tendon cells, THETCs)在PLA和PLGA85/15材料表面上的粘附力学特性，试图阐明THETC与PLA和PLGA的表面相容性。

2材料与方法

2.1试剂与器材

丙酮(分析纯，重庆东方试剂厂)。聚赖氨酸(Poly-D-lysine, PDL, Sigma Co.)和牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA, BOEHRI-

NGER MANNHEIM Co.)分别制成2 μg/ml和50 μg/ml溶液。聚乳酸(Poly-DL-Lactide, Sigma Co.)、聚乳酸与羟基乙酸共聚物85/15(Poly-DL-Lactide-co-Glycolide 85/15, Sigma Co.)。微管吸吮技术实验系统包括微管拉制器(Sutter Instrument Co.)、显微操作系统(Opton Co.)、数据处理系统(Vidas 21, Kontron Co.)。小腔室(Chamber,自制)，电感测微仪(Tronic TTD60,Switzer Land)等。

2.2细胞培养及细胞悬液制备

细胞采用本研究室已经建立的THETCs，这种细胞是采用带有潮霉素(Hygromycin B)筛选标记的SV40温度依赖性质粒ptsA58H，经电穿孔法将其导入肌腱细胞并进行潮霉素B筛选，获得阳性克隆后进行扩增得到。复苏冷冻保存的第41～49代THETCs，用含10%小牛血清(Gibco Co.)的F-12培养基(Sigma Co.)加入青霉素100 u/ml，链霉素100 μg/ml，制成pH值为7.2的完全培养液，在37℃、5%CO₂条件下培养。待细胞长成单层后，用0.25%胰蛋白酶液消化，使细胞悬浮分布均匀，按1∶2分瓶传代培养。取对数生长期的细胞(一般4～6 d)，消化离心，用不含小牛血清的F-12培养基制成1×10⁴/ml细胞悬液，作为接种细胞待用。

2.3聚合物薄膜的制备及其膜厚测量

分别将PLA和PLGA85/15各0.25 g溶于8 ml丙酮制成聚合物溶液。将载玻片(长76.2 mm，宽25.4 mm，厚1.1 mm)浸酸，洗净，浸于75%乙醇中消毒备用。在载玻片上制作直径约25 mm的小腔室(用20 ml一次性使用注射器外筒割制)。在离心机转头顶部放置小腔室，开动离心机(300 rpm)，在小腔室中心滴入0.3 ml聚合物溶液。溶液因离心作用而在小腔室底部载玻片上均匀铺展，形成聚合物薄膜。待有机溶剂充分挥发后，在紫外线下照射灭菌备用。用分辨率为1 μm的电感测微仪，机座用比长仪作运动导轨，对制作的聚合物薄膜进行膜厚测量。

2.4细胞与聚合物薄膜粘附力学测量方法

将细胞悬液接种到小腔室中的聚合物薄膜上，待细胞与材料作用15 min后，将小腔室置于显微镜载物台上。用微管拉制器将玻璃毛细管(直径1.0 mm，国产)拉成管口直径为3～8 μm的微管，充入培养液(无小牛血清)后架于微操纵器上。微管尖端插入细胞培养室中，另一端与压力系统相连。在显微镜下移动微操纵器使微管尖端靠近粘附于材料薄膜上的细胞。通过调节压力使细胞吸附于微管尖端。然后沿水平方向移动微管，开始细胞将发生变形，随着微管的移动，细胞变形增大，施加于细胞与材料接触部的力也增大。当此力等于细胞与材料间粘附力时，细胞从材料表面分开，见图1所示。细胞与材料间的切向粘附力由下式给出^［4］：F_a=πR²_pΔPsinθ_pcosθ，式中R_p为微管尖端内径，ΔP为微管内负压，θ_p为细胞与材料分开瞬间细胞在微管入口处细胞膜的切线方向与微管管口平面的夹角，θ为微管与材料表面的夹角。将实验过程录像并记录下压力值，整个实验过程在90 min内完成，然后通过数据处理系统回放录相带，测定R_p及θ_p，最后计算出细胞与膜材料的粘附力F_a。细胞粘附率定义为粘附细胞占测量细胞数的百分比，微管尖端靠近细胞时微小正压(约2mmH₂O)使细胞脱离时认为此细胞为未粘附细胞。实验分三组进行，第一组实验将细胞接种于PLA膜和PLGA85/15膜上(作为对照组)；第二组实验将细胞接种于裱衬有50 μg/ml BSA的PLA膜和PLGA85/15膜上；第三组实验将细胞接种于裱衬有2 μg/ml PDL的PLA膜和PLGA85/15膜上。统计学处理用t检验。

图1实验过程与装置

Fig 1Schematic diagram of the in vitro experimental process

3结果

(1)聚合物薄膜厚度的测定结果显示，PLA膜和PLGA85/15膜的平均厚度分别为18.6 μm和17.4 μm，PLA膜厚最大值和最小值分别为24 μm和9 μm，PLGA85/15膜厚度最大值和最小值分别为29 μm和6 μm。按本文方法获得的聚合物薄膜均匀度较好，在倒置显微镜下具有良好的透光性，便于采用微管实验系统测定细胞与薄膜的粘附特性，同时保证细胞是与材料作用，而不是与其衬底玻璃作用；

(2)THETC在PLA和PLG85/15膜上的粘附力及粘附率测定结果见表1、表2；

(3)THETC与PLA膜和PLGA85/15膜表面粘附力学特性比较的统计结果见图2。

表1THETC在PLA薄膜上